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GENESIS (TU Graz) wieder logarithmiert, medianzentriert und das „Manhattan-Abstandsmaß“
ermittelt. Auf diese Weise werden die Gene schrittweise gruppiert und im weiteren Verlauf durch Fusion von Gruppen zu größeren Gruppen ein hierarchisches System erzeugt, welches in einem Dendrogramm visualisiert werden kann.
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Die elektrophoretische Auftrennung von 20 μg Protein erfolgte in 4-12 %-igen Bis-Tris-Gradientengelen. Die Proben wurden zunächst in einem Volumen von 20 µL mit 2 μL Denaturierungspuffer und 6 μL Laufpuffer versetzt und 5 min bei 95 °C denaturiert. Die Elektrophorese erfolgte in einer Gelkammer („XCell Sure lockTM“) in 1xMES-Laufpuffer bei 120 V und 4 °C. Zur Größenbestimmung wurde ein Molekulargewichtsstandard mitgeführt (PageRuler Prestained Protein Ladder).
3.3.3.2 Transfer
Die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine wurden via „Tank-Blot-Verfahren“ mittels einer Mini Trans-Blot Cell-Apperatur auf eine PVDF-Membran (0,45 μm Porengröße) übertragen. Die Membran wurde zuvor zur Aktivierung eine Minute in MeOH geschwenkt und dann in 1xTransferpuffer äquilibriert. Der Transfer erfolgte in 1xTransferpuffer für 2 h bei 150 V und 4 °C.
3.3.3.3 Ponceau-S-Färbung
Nach dem Western-Transfer wurden die Proteine durch Färbung mit Ponceau-S visualisiert.
Hierzu wurde die PVDF-Membran für 5 min in 1 %-ige Ponceau-S Lösung inkubiert und der überschüssige Farbstoff mit Aqua bidest. abgewaschen. Mithilfe der rot angefärbten Proteine konnten die aufgetragene Proteinmenge der Proben und die Qualität des Blots überprüft werden. Die Entfärbung der Membran erfolgte mit 1xTBS-T.
3.3.3.4 Immunodetektion
Um unspezifische Bindungen der Antikörper an die PVDF-Membran auszuschließen, wurde diese zunächst für 15 min in 2 % Magermilchpulver/TBS-T-Puffer (w/v) inkubiert. Der Primärantikörper wurde in geeigneter Verdünnung zum 2 % Magermilch/TBS-T-Puffer (w/v) hinzugegeben und über Nacht bei 4 °C mit der PVDF-Membran unter Schütteln inkubiert.
Um nichtgebundene Antikörper zu entfernen, wurde die Membran drei Mal für 15 min mit 1xTBS-T gewaschen. Zum indirekten Nachweis der immobillisierten Proteine wurde ein Meerrettichperoxidase-gekoppelter sekundärer Antikörper verwendet. Dieser wurde in 2 % Magermilch/TBS-T (w/v) verdünnt und die Membran für 1 h bei RT inkubiert. Ungebundene sekundäre Antikörper wurden durch dreimaliges Waschen mit 1xTBS-T entfernt. Die Detektion erfolgte unter Anwendung des „ECL-Plus-Verfahrens“. Die Lösungen enthalten ein Substrat der Meerrettichperoxidase, welches unter Bildung von Sauerstoffradikalen die Oxidation von Luminol bewirkt. Die Reaktion wurde mittels Kodak Biomax MR-Röntgenfilms
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detektiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Röntgenfilmfixierer (Kodak) abgestoppt, die Entwicklung erfolgte mittels Röntgenfilmentwickler (Kodak).
3.3.4 Electrophoretic mobility shift assay
Der electrophoretic mobility shift assay (EMSA) ist ein molekularbiologisches Verfahren zur Detektion der Interaktion von Proteinen mit Nukleinsäuren in vitro. Hierzu wird ein biotinmarkiertes Oligonukleotid mit Proteinlysat inkubiert. Diese Komplexe wandern langsamer im elektrischen Feld durch ein Polyacrylamidgel als freie DNA (shift). Zur Überprüfung der Identität des an die DNA gebunden Proteins, kann die Analyse in Gegenwart eines gegen das Protein gerichteten Antikörpers durchgeführt werden. Tritt hierbei eine Bande mit zusätzlich verzögertem Laufverhalten auf (supershift), lässt sich das Protein spezifisch nachweisen. Die Durchführung erfolgte mit dem Lightshift EMSA Kit.
3.3.4.1 Herstellung von biotinylierten Oligonukleotidsonden
Die Biotinmarkierung der Oligonukleotide am 3'OH-Ende zum späteren Nachweis der DNA-Protein-Interaktion mittels Chemolumineszenz wurde mittels Biotin 3' End DNA Labeling Kit durchgeführt. Um eine optimale Biotinylierung zu erreichen, wurden die Sonden zunächst einzelsträngig behandelt. Der Einfachansatz setzt sich wie folgt zusammen:
25 µL nukleasefreies Wasser 10 µL TdT Reaktionspuffer 5 µL Biotin-11-UTP (5µM)
5 µL terminale Desoxyribonukleotidyltransferase (TdT) (1,5 U/µL) 5 µL Oligonukleotid (1 µM)
Die Reaktion wurde für 30 min bei 37 °C inkubiert und durch Zugabe von 2,5 µL 200 mM ETDA abgestoppt. Die Extraktion der TdT erfolgte durch Zugabe von 50 µL Isopropanol/Chloroform (1:25). Der Ansatz wurde gut gemischt, für eine Minute bei 13.000 rpm zentrifugiert und die DNA-haltige Oberphase abgenommen. Zur Generierung von dsDNA-Sonden wurden gleiche Anteile an markierten komplementären Oligonukleotiden für 1 min bei 90 °C denaturiert und langsam mit -0,1 °C/s zu Doppelstrangoligonukleotiden verbunden.
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3.3.4.2 Gewinnung von Kern- und Cytoplasmaextrakten aus Zellkultur
Die zellulären Extrakte wurden mit dem NE-PER Nuclear and Cytoplasmatic Extraction Kit gewonnen. Für eine Anreicherung hochkonzentrierter Proteinlysate wurden 2x106 Zellen mit 200 µL hypotonischem Puffer CER I versetzt, gründlich gemischt und 10 min auf Eis inkubiert.
Durch die anschließende Zugabe von 11 µL detergenzhaltigem Puffer CER II wurde die Zellmembran lysiert. Der Ansatz wurde für 1 min auf Eis inkubiert und dann für 1 min bei 13.000 rpm und 4 °C zentrifugiert. Der im Überstand enthaltene Cytoplasmaextrakt wurde bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert. Die kernhaltige Fraktion wurde in 100 µL Puffer NER resuspendiert und 40 min auf Eis inkubiert. Dabei wurde der Ansatz alle 10 min gut gemischt. Zur Trennung der Kernproteine von den übrigen Zelltrümmern wurde für 10 min bei 13.000 rpm und 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wurde verworfen und die zellulären Kernextrakte bei -20 °C aufbewahrt.
3.3.4.3 Bindungsreaktion und Gelelektrophorese
In einem 18 μL Ansatz wurden folgende Komponenten gemischt und für 5 min bei RT äquilibriert:
2 µL 10xBindepuffer 2 µL Poly (dI/dC) (1µg/µL) 1 µL 50 % Glycerol
5 µg Proteinextrakt
Dann wurden 2 µL einer 1:20-Verdünnung der markierten Oligonukleotidsonde (entspricht 20 fmol Biotinmarkierung) hinzugegeben und für weitere 30 min inkubiert. Für supershift-Analysen wird dem Reaktionsansatz der entsprechende Antikörper vor Zugabe des markierten Oligonukleotids zugesetzt und mit diesem für 60 min bei 4 °C präinkubiert. Nach einem Gelvorlauf von 20 min bei 100 V wurden die Proben mit Ladepuffer versetzt und auf ein 6 %-iges DNA Retardation Gel aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgt für 2 h bei 120 V und 380 mA in 0,5xTris-Glycin-Puffer bei 4 °C.
3.3.4.4 Blotting und Detektion
Die elektrophoretisch aufgetrennten Protein-DNA-Komplexe wurden via „Tank-Blot-Verfahren“ auf eine Nylon-Membran übertragen. Die Membran wurde zuvor für 10 min 1xTBE-Puffer äquilibriert. Der Transfer erfolgte in 1xTBE-Puffer für 30 min bei 380 mA und
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4 °C. Die Fixierung der DNA auf der Nylon-Membran erfolgte mittels UV-Transilluminator bei 254 nm für 2 min. Um unspezifische Bindungsstellen auf der Membran abzusättigen wurde diese mit 20 mL Blockierungspuffer für 15 min unter leichtem Schütteln inkubiert. Dann wurde in einer 1:300-Verdünnung das biotinbindende Streptavidin-Meerettichperoxidase-Konjugat hinzugegeben und für weitere 15 min inkubiert. Vor der Detektion wurde die Membran vier Mal für je 10 min in 1xWaschpuffer gewaschen um das überschüssige Konjugat zu entfernen. Durch eine Chemilumineszenzreaktion wurden die DNA-Protein-Komplexe auf einem geeigneten Röntgenfilm nachgewiesen.
3.3.5 Statistik
Die Ergebnisse der Zellkulturexperimente sind als Mittelwerte ± Standardabweichung (SD) mittels EXCEL 2010 (Microsoft) dargestellt. Die jeweilige Signifikanzberechnung erfolgte mit Hilfe des ungepaarten Student’s t-Test, der unter Annahme unterschiedlicher Varianzen der Stichproben durchgeführt wurde. Eine Irrtumswahrscheinlichkeit von weniger als 5 % (p<0,05) gilt hierbei als signifikant.
Die statistische Auswertung der Patientendaten erfolgte mit der Software SPSS STATISTICS 20.0 (IBM). Für die Bewertung der Assoziation zwischen der mRNA-Expression der humanen Gene PIWIL1-4 und klinischem Ejakulatparametern wurden Bivariate Korrelationsanalysen nach Spearman-Rho und nichtparametrische Tests (Mann-Whitney-U-Test) durchgeführt. p<0,05 wurde als signifikant angesehen.
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4 Ergebnisse
Das Ziel dieser Arbeit war es, die Bedeutung der PIWIL-Gene für die menschliche Spermatogenese darzustellen. Im folgenden Teilprojekt sollte untersucht werden, ob Patienten mit eingeschränkten Ejakulatparametern eine dysregulierte mRNA-Expression der PIWIL-Homologe 1-4 aufweisen und welche Auswirkungen eine mögliche Veränderung auf die Bildung reifer Spermatozoen hinsichtlich normozoospermer Ejakulatparameter haben könnten.