Proteinbiochemische Methoden

2.2.3.1 Gewinnung der Proteine

Zunächst wurden entsprechend der RNA-Gewinnung die verwendeten Zelllinien wie in Kapitel 2.2.1.4 beschrieben in 6-Wellplatten ausgesät und 12 h später zu einem Kokultursystem zusammengefügt. Wie in Kapitel 2.2.1.5 dargestellt, erfolgte die Stimulation mit den unterschiedlichen Kisspeptin-10 Konzentrationen in einem Abstand von 12 h für insgesamt 24 h.

Die Ernte der MCF-7 Zellen erfolgte mit Hilfe eines Spatels mitsamt dem Matrigel und anschließendem Lösen in PBS. Die Proben wurden bei 300 x g für 5 min abzentrifugiert und sogleich in Stickstoff gefroren. Die Lagerung der Proben erfolgte bei -80°C.

Das SDF1-Protein wurde aus dem Überstand der MG-63 Zellen gewonnen, da es sich um ein sekretorisches Protein handelt. Dazu wurden die Überstände von drei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten gepoolt und bei 3000 x g für 90 min ultrazentrifugiert, um das Protein aufzukonzentrieren. Das Ultrazentrifugieren der Proben wurde mit Vivaspin-6 ml von Sartorius Biotech durchgeführt. Hierbei handelt es sich um Zentrifugenröhrchen mit 2 Kammern, die durch eine Membran

getrennt sind. Diese Membran ist so konfiguriert, dass diese für alle Proteine < 5 kDa durchlässig ist. Das SDF-1 Protein weist eine Größe von 10 kDa auf und kann somit in der oberen Kammer aufkonzentriert werden. Die Proben wurden bei -80°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.

2.2.3.2 Aufbereitung der membranständigen und zytosolischen Proteine

Zunächst wurden die Zellpellets für die Herstellung von Zelllysaten mit PBS gewaschen und bei 300 x g für 5 min zentrifugiert. Anschließend erfolgte die Resuspension der Zellpellets in Triton X-114^TM-Puffer (Sigma-Aldrich) nach Bordier (1981) und die Zugabe eines Protease-Inhibitor-Cocktails (Sigma-Aldrich), um den Abbau der Proteine zu verhindern. Diese wurden bei 4°C über Nacht im Überkopfschüttler (Heto, Allered, DK) inkubiert. Am nächsten Tag erfolgte das Abtrennen unlöslicher Rückstände in der Kühlzentrifuge bei 12000 x g und 4°C für 25 min. Im Anschluss wurde der Überstand abgenommen und für 10 min bei 37°C und 800 rpm im Thermomixer inkubiert. Daraufhin folgte ein Zentrifugationsschritt für 5 min bei 10000 x g und RT. Hierbei wurde das Zelllysat in zwei Phasen, die zytosolische (obere Phase) und membranständige (untere Phase) Proteinfraktion aufgetrennt. Durch Zugabe von fünf Volumenteilen Aceton wurde die benötigte Proteinfraktion über Nacht bei -20°C gefällt. Es folgte ein Zentrifugationsschritt (25 min, 12000 x g, 4°C). Der Überstand wurde verworfen und die gewonnenen Proteinpellets in der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt.

2.2.3.3 Aufbereitung des sekretorischen SDF-1 Proteins

Für die Denaturierung des SDF-1 Proteins wurden die Proben im Thermomixer für 10 min bei 37°C und 800 rpm inkubiert. Bis zur weiteren Verwendung erfolgte die Lagerung der Proben auf Eis.

2.2.3.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ist eine Methode, welche Proteine nach ihrer Größe auftrennt. Das SDS (sodium dodecyl sulfate) ist ein anionisches Detergens, das an die Proteine bindet und diese somit eine negative Ladung erhalten.

Bei dem verwendeten Verfahren nach Laemmli werden die Proben in einem Sammelgel mit 5 % Polyacrylamid (Tab. 2.10) konzentriert und danach im 10 %igen oder 15 %igen Trenngel (Tab. 2.11) separiert (Laemmli 1970). Für die SDS-Page wurde die Mini-PROTEAN III Electrophoresis Cell Apparatur von Bio-Rad verwendet und nach Angaben des Herstellers aufgebaut.

Tab. 2.10: 5 %iges Sammelgel

Material Einsatz

ddH2O 3,1 ml

Prosieve 50 Gel Solution (Cambrex) 0,5 ml

1,0 mM Tris 1,3 ml

10 % SDS 50 µl

10 % APS 50 µl

TEMED 4 µl

Tab. 2.11: 10 %iges und 15 %iges Trenngel

Material 10 % Trenngel 15 % Trenngel (SDF-1)

ddH2O 5,3 ml 4,3 ml

Prosieve 50 Gel Solution (Cambrex) 2,0 ml 3 ml

1,0 mM Tris 2,5 ml 2,5 ml

10 % SDS 100 µl 100 µl

10 % APS 100 µl 100 µl

TEMED 4 µl 4 µl

Das Sammelgel wurde in der ersten Geltasche mit einem Molekularmassenmarker (peqGOLD Protein Marker, Peqlab) beladen, in alle weiteren Geltaschen erfolgte das Auftragen der Proben. Vor dem Auftragen der Proben in die Geltaschen des Sammelgels wurden diese mit zweifach konzentriertem Laemmli-Probenpuffer versetzt.

Die Elektrophorese erfolgte zunächst bei 80 Vconst für 30 min und im Anschluss bei 150 Vconst für 60 min in SDS-Elektrophorese-Puffer.

Die aufgetrennten Proteine konnten nun im Western Blot Verfahren auf Nitrocellulose-Membranen transferiert und nachgewiesen werden.

2.2.3.5 Western Blot

Das Western Blot Verfahren dient dazu, die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine auf eine Trägermembran zu übertragen und diese im Anschluss über spezifische Antikörper nachzuweisen (Towbin et al. 1979).

Die Apparaturvorrichtung (Bio-Rad) wurde laut den Angaben des Herstellers aufgebaut. Hierfür wurde das SDS-Gel auf die Nitrocellulosemembran (Hybond-ECL^TM, Amersham Bioscience) luftblasenfrei aufgebracht und zwischen je zwei in Transferpuffer getränkte Filterpapiere (Whatman, Schleicher & Schuell) gelegt. Beim Einspannen des Sandwiches zwischen zwei Schaumstoffschichten war zu beachten, dass die Nitrocellulosemembran der Anode zugewandt ist. Anschließend konnte der Transfer bei 100 Vconst für 1 h durchgeführt werden. Als Transferkontrolle diente der vorgefärbte Molekularmassenmarker.

2.2.3.6 Detektion und Visualisierung

Nach dem Transfer erfolgte die Inkubation der Nitrocellulosemembran mit einer Blocking-Solution für 1 h, um unspezifische Bindungsstellen abzusättigen. Im Anschluss wurde die Membran mit TBST für 15 min gewaschen. Dieser Waschgang wurde insgesamt viermal wiederholt. Danach erfolgte die Inkubation mit dem Primärantikörper über Nacht bei 4°C.

Im Folgenden wurde der oben genannte Waschgang wiederum viermal durchgeführt, um im Anschluss den Peroxidase-gekoppelten Sekundärantikörper für 1 h bei RT zu inkubieren.

Nach erneuter Durchführung der vier Waschgänge konnte nun die Detektion des gebundenen Sekundärantikörpers mittels ECL (enhanced chemiluminescens reaction, Immobilon^TM Western, Millipore) erfolgen. Das ECL zeigt bei der katalytischen Umsetzung durch die Peroxidase eine Chemilumineszenz mit einem Maximum bei λ = 430 nm, mit der Röntgenfilme (Kodak) belichtet werden können.

Die Exposition erfolgte in einer Röntgenfilmkassette (X-Ray GmbH) und der Film wurde anschließend in einer Dunkelkammer im X-Ray Film Prozessor SRS-101A entwickelt.

2.2.3.7 Strippen von Nitrocellulosemembranen

Um eine Nitrocellulosemembran erneut mit einem Primärantikörper zu hybridisieren, muss die Membran gestrippt werden. Dies bedeutet, dass die Membran von den schon gebundenen Antikörpern befreit wird. Der dazu benötigte Antibody Stripping Buffer wurde von der Firma Uptima Interchim bezogen. Die Membran wurde für 15 min bei RT und 1000 rpm mit diesem Puffer inkubiert. Es folgte ein Waschvorgang mit ddH20 und anschließend konnte die Membran erneut geblockt und mit dem neuen Primärantikörper behandelt werden.