Proteinbiochemische Methoden

3.2.1 Konzentrationsbestimmung von Proteinen

Proteinkonzentrationen können mit dem Protein Assay der Firma Bio-Rad, basierend auf der Bradford-Methode (Bradford, 1976), nach Herstellerangaben bestimmt werden. Die optische Dichte wird bei 595 nm gemessen. Wurden bereits Detergenzien den Proteinlösungen zugefügt, empfiehlt sich jedoch eine Konzentrationsbestimmung mit dem BCA-Assay der Firma Pierce (Rockland, USA) gemäß Herstellerangaben. Die optische Dichte wird dabei ebenfalls bei 595 nm gemessen. Als Kalibrierungsgerade dienen die Messwerte von BSA-Lösungen bekannter Konzentrationen.

3.2.2 SDS-PAGE zur Auftrennung von Proteinen (Fling und Gregerson, 1986)

Durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) können Proteine entsprechend ihres Molekulargewichts aufgetrennt werden. Das für die Denaturierung verwendete SDS ist in der Lage, Polypeptidketten aufzuspalten und diese dann einheitlich mit einer negativen Ladung (ca. ein SDS-Molekül pro drei Peptidreste) zu beladen. Die mit dem Molekulargewicht zunehmende negative Gesamtladung der Proteine führt im elektrischen Feld zur Auftrennung der Proteine nach Größe. Durch die Verwendung von Dithiothreitol werden vorhandene Disulfidbrücken reduziert und damit die Protein-Tertiärstruktur aufgelöst. Bei der diskontinuierlichen SDS-PAGE, die für optimale Proteinauftrennung

Die Komponenten des Trenngels werden gemischt und zwischen zwei Glasplatten in eine Gießapparatur gegossen. Durch Beschichtung mit wassergesättigtem Butanol wird eine homogene Polymerisierung des Trenngels erzielt. Dieses wird nach der Polymerisation des Gels mit H2O abgespült und die Kammer wird mit Filterpapier getrocknet. Nun werden die Komponenten des Sammelgels gemischt und auf das Trenngel gegossen. Durch das Einsetzen eines Kammes werden Taschen für das Beladen der Proben in das Sammelgel geformt. Das fertige Gel wird in eine Elektrophoresekammer gesetzt, die mit Laufpuffer gefüllt wird. Dann werden der Molekulargewichtsstandard und die Proben (in SDS-PAGE-Auftragspuffer) in die Taschen geladen. Die Auftrennung der Proteine erfolgt bei konstanter Stromstärke (20 mA pro Gel).

3.2.3 Transfer von Proteinen auf Nitrozellulosemembran (Towbin et al., 1979)

Mit Hilfe des Western-Blot-Verfahrens und anschließender Immundetektion lässt sich ein spezifisches Protein aus einem Proteingemisch mit sehr hoher Sensitivität nachweisen. Die Proben werden zunächst durch SDS-PAGE aufgetrennt, dann elektrophoretisch auf eine Nitrozellulosemembran transferiert und anschließend mit entsprechenden Antikörpern detektiert.

Der Transfer von Proteinen auf Nitrozellulose wird mit Hilfe eines Elektrotankblotters (Hoefer TE 42 Transphor) durchgeführt und erfolgt bei 40 mA und 4 °C über Nacht oder bei 250 mA und 4 °C für 2 Stunden in Blotting-Puffer. Das Gel wird zunächst luftblasenfrei auf eine mit Blotting-Puffer getränkte Nitrozellulosemembran aufgelegt. Sowohl unter die Membran als auch auf das Gel werden je drei Lagen mit Blotting-Puffer getränktes Whatman 3MM Papier gelegt und alles wird in der Blotkammer verschlossen. Zum Schluss kann durch Anfärben der Membran mit Ponceau S der Transfer sichtbar gemacht und somit überprüft werden. Diese Färbung kann mit PBS oder H2O entfernt werden.

3.2.4 Immundetektion von Proteinen durch Chemilumineszenz

Zum Nachweis eines immobilisierten Proteins auf einer Membran wird eine indirekte

Antikörperbindungsstellen auf der Membran durch Inkubation in Blockierungslösung (1 x TBS; 0,1 % Tween 20; 5 % Ziegenserum; 5 % Magermilch) für mindestens 30 Min abgesättigt. Die Zugabe des primären Antikörpers, der ein Epitop des gesuchten Proteins bindet, erfolgt ebenfalls in Blockierungslösung für eine Stunde bei Raumtemperatur.

Anschließend wird die Membran fünfmal für je 5 Min in 1 x TBS-T (1 x TBS; 0,1 % Tween 20) gewaschen. Der sekundäre Antikörper wird für 1 Std bei Raumtemperatur in Blockierungslösung inkubiert. Er ist Spezies-spezifisch und reagiert mit den schweren Ketten des primären Antikörpers. Durch die Kopplung einer Meerrettich-Peroxidase an den sekundären Antikörper kann eine Chemilumineszenz-Reaktion katalysiert werden. Die Membran wird danach wieder fünfmal für je 5 Min in 1 x TBS-T und zweimal je 5 Min in 1 x TBS gewaschen. Dann wird sie auf eine Glasplatte gelegt und mit 40 µl ECL-Reagenz pro 1 cm² Membran für 1 Min inkubiert. Die an den sekundären Antikörper gekoppelte Peroxidase katalysiert die Reduktion von Wasserstoffperoxid zu Wasser und atomaren Sauerstoff. Dieser kann Luminol unter Abspaltung von Stickstoff oxidieren, wobei Luminol Licht emittiert. Das verstärkte Chemilumineszenz-System (ECL), deren wesentliche Komponenten Wasserstoffperoxid und Luminol sind, erzeugt stärkere Signale, die über einen längeren Zeitraum konstant bleiben. Die Visualisierung des Signals erfolgt in einer Dunkelkammer durch Exposition eines Röntgenfilms auf der Membran, wobei die Expositionszeit je nach Intensität der Banden und der Antikörpersensitivität variiert. Der Film wird durch Auflegen einer Transparentfolie vor Feuchtigkeit geschützt und anschließend in einer Entwicklermaschine fixiert und entwickelt.

3.2.5 Quantifizierung von Proteinen mittels ECL-Western-Blot

Die durch den ECL-Western-Blot visualisierten Banden können mit Hilfe der ImageJ-Software quantifiziert werden. Dazu werden zunächst gleiche Mengen der jeweiligen Protein-Proben durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulosemembran transferiert.

Bei der anschließenden Immundetektion von Proteinen durch Chemilumineszenz (ECL-Western-Blot) wird auch in den Waschschritten 5 % Ziegenserum zugegeben, um schärfere Signale und möglichst keine Hintergrundsignale zu erhalten. Die Intensitäten dieser Banden werden dann mittels der ImageJ-Software bestimmt. Um Verfälschungen der

3.2.6 Immundetektion von Proteinen durch Fluoreszenz

Unspezifische Antikörperbindungsstellen auf der Membran werden durch die Inkubation in Odyssey Blocking Buffer (1:1 in 1 x PBS verdünnt) für 1 Std abgesättigt. Die Zugabe des primären Antikörpers erfolgt in Odyssey Blocking Buffer (1:1 in 1 x PBS verdünnt) mit 0,1 % Tween 20 für 1 Std bei Raumtemperatur. Die Membranen werden dann viermal für 10 Min in 1 x PBS-T (1 x PBS; 0,1 % Tween 20) gewaschen, bevor der sekundäre Antikörper in Odyssey Blocking Buffer (1:1 in 1 x PBS verdünnt) mit 0,1 % Tween 20 für 1 Std bei Raumtemperatur inkubiert wird. Da der sekundäre Antikörper mit Alexa Fluor 680 fluoreszenzmarkiert ist, erfolgt die Inkubation und alle folgenden Schritte im Dunkeln.

Zum Schluss wird die Membran viermal für 10 Min in 1 x PBS-T gewaschen und in 1 x PBS bei 4 °C aufbewahrt. Die Visualisierung der Signale erfolgt mit Hilfe des Li-Cor Odyssey Infrared Imaging System.

3.2.7 Quantifizierung von Proteinen mittels Odyssey-Western-Blot

Durch den Odyssey-Western-Blot visualisierte Banden werden mit Hilfe der Odyssey Software quantifiziert. Dazu werden zunächst gleiche Mengen der jeweiligen Protein-Proben durch SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend auf Nitrozellulosemembran transferiert. Die Detektion der Proteine erfolgt nun mittels Fluoreszenz, da die sekundären Antikörper Alexa Fluor 680 fluoreszenzmarkiert sind. Mit Hilfe des Li-Cor Odyssey Infrared Imaging System können die Fluoreszenzsignale visualisiert und mit der entsprechenden Software analysiert werden. Auch mit dieser Methode muss jeweils der Quotient zu einer entsprechenden Ladekontrolle (Rab3a oder Tubulin) gebildet werden, da die Menge der aufgetragenen Proben trotz vorheriger Konzentrationsbestimmung variieren kann.

3.2.8 Entfernen der Antikörper von einer Nitrozellulosemembran

Zur Entfernung der Antikörper von einer Nitrozellulosemembran wird diese in 2 % SDS, 62,5 mM Tris/HCl pH 6,7 auf 50 °C vorgewärmt. Dann wird β-Mercaptoethanol bis zur

50 °C inkubiert. Die Lösung wird abgegossen und die Membran zweimal für 10 Min bei Raumtemperatur mit TBS gewaschen.

Eine sanftere Methode ist die Entfernung der Antikörper von der Membran bei 37 °C in 100 mM Glycin pH 2,5 - 3 für 30 Min. Anschließend wird die Membran zwei- bis dreimal in 1 x TBS; 5 % Ziegenserum gewaschen.

In beiden Fällen können die Membranen anschließend neu für Immundetektionen eingesetzt werden.

3.2.9 Präparation von P2-Fraktionen aus Mausgehirn

Die Mäuse werden zunächst durch Inhalation des Anästhetikums Isofluran betäubt. Alle anschließenden präparativen Schritte erfolgen auf Eis. Das Gehirn wird herauspräpariert, gegebenenfalls eine gewünschten Gehirnregionen isoliert und in 1 ml eiskalte gepufferte 320 mM Saccharose-Lösung (20 mM Hepes pH 7,4; 5 mM EDTA; Protease-Inhibitoren) gegeben. Die Homogenisierung erfolg auf mittlerer Stufe mit dem Dispergiergerät Ultra-Turrax. Das Homogenat wird anschließend 10 Min bei 4.900 g und 4 °C zentrifugiert (3.300 U/Min, Eppendorf 5403), um Zellkerne und unzureichend zerkleinertes Gewebe zu sedimentieren. Der Überstand wird nochmals bei 19.000 g (12.800 U/Min, Eppendorf 5403) und 4 °C für 10 Min zentrifugiert und das ungereinigte, synaptosomale Sediment (engl. pellet, P2-Fraktion) wird in einem entsprechenden Volumen gepufferter Saccharose-Lösung aufgenommen.

3.2.10 Präparation von Synaptosomen aus Mausgehirn

Alle Schritte nach der Gehirnentnahme erfolgen auf Eis und alle Zentrifugationsschritte bei 4 °C. Pro präpariertes Gehirn werden 10 ml eiskalte 320 mM Saccharose-Lösung zugegeben. Mit Hilfe eines Glas-Teflon-Potters werden die Gehirne jeweils durch achtmaliges Auf- und Abziehen bei 9000 U/Min homogenisiert und anschließend bei 2.990 g (5.000 U/Min) für 2 Min in einem SS34 Rotor zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen und erneut bei 14.500 g (11.000 U/Min) für 12 Min zentrifugiert. In der

Saccharose-Lösung mit 1 ml 9 % Ficoll in 320 mM Saccharose-Lösung und als letztes mit 4 ml 6 % Ficoll in 320 mM Saccharose-Lösung überschichtet werden. Anschließend wird das Sediment aus dem letzten Zentrifugationsschritt in 1 ml 320 mM Saccharose-Lösung aufgenommen und vorsichtig auf den Gradienten gegeben. Die Gefäße werden in Zentrifugationsbehälter gegeben und mit 320 mM Saccharose-Lösung austariert. Die Zentrifugation erfolgt in einem SW 41-Ti swing-out Rotor in einer Ultrazentrifuge bei 81.000 g (22.500 U/Min) für 35 Min. An den Grenzen der Gradienten sammeln sich jeweils zwei Banden, die entnommen und nochmals bei 22.200 g für 20 Min zentrifugiert werden (15.000 U/Min, Eppendorf 5403). Das Sediment wird je nach Größe in einem entsprechenden Volumen (100 - 200 µl) H2O aufgenommen.

Anschließend wird eine Proteinkonzentrationsbestimmung mit der BCA-Methode durchgeführt (s. 3.2.1) und die Proben so mit H2O und SDS-PAGE-Auftragspuffer versetzt, dass sie eine einheitliche Proteinkonzentration aufweisen. Zur Quantifizierung bestimmter Proteine wird das Proteingemisch durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrozellulosemembran übertragen und mit Hilfe des Odyssey-Western-Blot-Verfahrens analysiert (s. 3.2.6).

3.2.11 Präparation von PSD enthaltenen Fraktionen aus Mausgehirn

Die entsprechenden Gehirnregionen werden wie in 3.2.9 präpariert, in 1,5 ml gepufferte 320 mM Saccharose-Lösung gegeben und in einem 5 ml Glas-Teflon-Potter bei 9000 U/Min homogenisiert. Die Homogenate werden wie unter 3.2.9 beschrieben zentrifugiert und die erhaltene P2 Fraktionen in einem entsprechenden Volumen (50 - 100 µl) 20 mM Tris pH 7,4; 2 mM EGTA; 1 mM PMSF aufgenommen. Die Konzentrationen der Proteinproben werden mit der Bradford-Methode (s. 3.2.1) gemessen und einheitlich auf eine Proteinkonzentration von 2 mg/ml mit einer Endkonzentration von 1 % Triton X-100 eingestellt. In einem Ultraschallbad werden die Proben dreimal 30 Sek bei 70 % sonifiziert (Ultraschallbad DK 102 von Bandelin) und zwischendrin für 30 Sek auf Eis inkubiert.

Anschließend werden die Proben für 1 Std auf einem sich langsam drehenden Rad bei 4 °C inkubiert. Das Solubilisat enthält die Triton X-100 löslichen Proteine und wird mittels Ultrazentrifugation (1 Std bei 136.600 g, 57.000 U/Min im TLA 120.1 Rotor bei 4 °C) von der PSD enthaltenen Fraktion mit den Triton X-100 unlöslichen Proteinen getrennt. Das

aufgenommen. Anschließend werden 0,9 Volumen 20 mM Tris pH 7,4, 2 mM EGTA, 1 mM PMSF und 1 % Triton X-100 zugefügt und die Proben erneut auf einem sich langsam drehenden Rad bei 4 °C für 1 Std inkubiert.

Die Proteinkonzentrationen werden mit Hilfe der BCA-Methode (s. 3.2.1) gemessen und auf eine einheitliche Konzentration (optimal 2 mg/ml) in SDS-PAGE Auftragspuffer gebracht. Um die in den Fraktionen enthaltenen Proteine zu quantifizieren werden die Proteine durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrozellulosemembran übertragen und mittels des ECL-Western-Blot-Verfahrens (3.2.4) untersucht.