Expressionsanalysen auf Proteinebene wurden anhand von SDS-Gelelektrophoresen (SDS-PAGE) in Kombination mit Western-Blots durchgeführt. Dies erlaubt eine schnelle und valide Verifizie-rung der RT-qPCR basierenden mRNA-Expressionsanalysen auf Proteinebene. Bei der SDS-PAGE nutzt man die Eigenschaft von Proteinen Sodiumdodecylsulfat (SDS) zu binden, was zu negativ geladenen SDS-Protein-Komplexen (Ladung~Masse) führt. SDS denaturiert in Kombination mit dem im Probenpuffer enthaltenem β-Mercaptoethanol Proteine und unterbindet damit Protein-Protein-Wechselwirkungen (Tertiär-/Quartiärstrukturen). Dadurch unterscheiden sich die Proteine nur noch in ihrer Größe bzw. ihrem Molekulargewicht. Im SDS-Gel wandern die Proteine ent-sprechend der angelegten Spannung zum Pluspol und werden durch den Molekularsiebeffekt der
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Polyacrylamidmatrix ihrem Molekulargewicht entsprechend aufgetrennt. Im Western-Blot werden die Proteine elektrophoretisch auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran übertragen. Auf der Membran können Proteine durch spezifische Antikörper gebunden und mit Farbreaktionen sichtbar gemacht werden, was Aussagen über Vorhandensein und Menge eines Proteins erlaubt.
4.3.1 Proteinlysate in RIPA-Puffer
Zur Extraktion von Gesamtprotein wurden Zellen in Kulturschalen zweimal mit PBS gewaschen und mit 100 µl RIPA-Puffer pro 5 x 106 Zellen überschichtet. Dann wurden die Zellen mit einem Zellschaber vom Boden der Platten geschabt und mit einer Pipette in ein Eppendorfgefäß über-führt. Nach 1 Minute vortexen wurden die Zellen 20 Minuten auf -20 °C inkubiert und anschließend nochmals 1 Minute gevortext. Hierauf folgte eine Zentrifugation (15 min, 13000 x g) und anschlie-ßende Aliquotierung der Überstände. Diese wurden zur Proteinbestimmung verwendet und bei -80 °C gelagert.
4.3.2 Proteinbestimmung
Zur Proteinbestimmung wurde der DC Protein Assay von Biorad (München, Deutschland) ver-wendet. Der Assay basiert auf dem Lowry-Test, bei dem Protein mit Cu2+-Ionen in alkalischer Lösung einen Komplex bildet (Biuret-Reaktion). Diese gebundenen Cu2+-Ionen werden zu Cu+ -Ionen reduziert und bilden zusammen mit einem Folin-Reagenz einen blauen Komplex, der als Maß der Proteinkonzentration dient. Zur Konzentrationsbestimmung dient eine interne Standardkurve bekannter Konzentrationen aus BSA.
4.3.3 SDS-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Zur elektrophoretischen Auftrennung von Proteinen wurde das diskontinuierliche Lämmli-System verwendet. Bezüglich des Molekulargewichts der in dieser Arbeit untersuchten Proteine wurden 12 %ige SDS-Gele (optimal für MProtein=20-60 kDa) verwendet.
Die Gele wurden meist einen Tag vor dem Lauf gegossen. Zum Gießen des Trenngels wurde Untergelstammlösung6 mit APS (5 µl/1 ml Stammlösung) und TEMED (1 µl/1 ml Stammlösung) als Polymerisationskatalysator vermischt und sofort in die Gelkammern gegossen. Anschließend wurde das Trenngel mit Isopropanol überschichtet. Nach ca. 30 min Polymerisationszeit wurde der Isopropanol abgegossen, zweimal mit verdünntem Untergelpuffer gespült und das Obergel mit der
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Obergelstammlösung7, APS und TEMED nach selbem Mischungsverhältnis darauf gegossen. Die Gele wurden bis zu 5 Tage, eingeschlagen in einem mit Untergelpuffer8getränkten Papierhandtuch, im Kühlschrank aufbewahrt.
Zur Elektrophorese wurden die Gele in die Kammern gesetzt und vollständig mit Lämmli-Puffer überschichtet. Ensprechende Mengen der Proteinlysate wurden mit 2 x SDS-Probenpuffer vermischt und 5 min bei 95 °C inkubiert. Anschließend wurden die Proben kurz auf Eis gestellt, abzentrifugiert und auf das Gel aufgetragen. Eine Geltasche wurde mit 5 µl Biorad Kaleidoskop Marker beladen um das Molekulargewicht der untersuchten Proteine abschätzen zu können.
Zum Durchlaufen des Sammelgels wurde eine Spannung von 60 V angelegt. Hatten die Proben das Trenngel erreicht wurde die Spannung auf 120-140 V erhöht, bis der Marker den unteren Rand des Gels erreichte.
4.3.3.1 Benötigte Puffer und Lösungen
• Acrylamid-Stammlösung
Acrylamid 146 g
mit H2O ad 500 ml, Lösung über Nacht im Kühlraum rühren und anschließend filtrieren
• Untergelpuffer
Tris/HCl 90,83 g
mit H2O ad 500 ml
• Obergelpuffer
Tris/HCl 30 g
mit H2O ad 500 ml
• SDS-Stammlösung
SDS 10 g
mit H2O ad 100 ml
• 1 M Tris-Puffer
Tris/HCl 13 g
mit H2O ad 100 ml
73 ml für kleines Gel, 6 ml für großes Gel
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• 2 x SDS-Probenpuffer
Glycerin 10 ml
Tris-Puffer 5 ml
SDS 2 g
β-Mercaptoethanol 5 ml
Bromphenolblau 10 mg
mit H2O ad 50 ml
• Ammoniumpersulfat-Lösung
Ammoniumpersulfat 100 mg
mit H2O ad 1 ml, im Kühlschrank max. 5 d haltbar
• 50 x TAE-Puffer
Tris-Base 242 g
Essigsäure 57,1 ml
0,5M EDTA pH 8,0 100 ml
mit H2O auf 1000 ml auffüllen
• 5 x Lämmli-Elektrodenpuffer
Tris 15 g
Glycin 216 g
SDS 15 g
mit H2O ad 3000 ml
• Gelstammlösungen
12% Trenngel 5% Sammelgel
Obergelpuffer - 25 ml
Untergelpuffer 25 ml
-SDS (10 %) 1 ml 1 ml
Acrylamid (30 %) 40 ml 16,65 ml
H2Obidest ad 100 ml ad 100 ml
4.3.4 Western-Blot
Im Anschluss an die SDS-Gelelektrophorese wurden die Proteine auf eine PVDF-Membran ge-blottet. Dazu wurde eine Halbtrockenzelle von Biometra (Göttingen, Deutschland) verwendet.
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PVDF-Membran wurde durch kurzes Schwenken in Methanol aktiviert und anschließend in An-odenpuffer B geschwenkt. Die Blot-Kammer wurde nach folgendem Prinzip zusammengebaut:
3 x Filterpapier (in Anodenpuffer C)
3 x Filterpapier (in Anodenpuffer B) 3 x Filterpapier (in Anodenpuffer A)
SDS-Gel
PDVF-Membran
oben
unten Kathode
-+ Anode -+
Abbildung 4.4:Schematischer Aufbau einer Western-Blot-Kammer
Geblottet wurde 60 min mit 0,8 mA pro cm2 Fläche des Blotzuschnitts. Im Anschluss daran wurden die restlichen Proteinbindungsstellen der PVDF-Membran durch einstündiges Blocken in 5 %iger Magermilchlösung abgesättigt. Die Immunfärbung erfolgte durch Inkubation mit spezifi-schen Antikörpern9 (1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht im Kühlschrank) und dem ECL-Detektions-Kit (Buckinghamshire, Großbritannien). Nach dem Blotten und zwischen den Färbeschritten mit Antikörpern wurde 3 x 15 min mit TBST-Lösung gewaschen.
Zur Quantifizierung von Proteinen wurde als Referenz β-Aktin verwendet.
4.3.4.1 Benötigte Puffer und Lösungen
• Anodenpuffer A
Tris/HCl 36,3 g
Methanol 200 ml
mit H2O ad 1000 ml
• Anodenpuffer B
Tris/HCl 3,03 g
Methanol 200 ml
mit H2O ad 1000 ml
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• Anodenpuffer C
-Amino-n-Capronsäure 5,2 g
Methanol 200 ml
mit H2O ad 1000 ml
• Block-Lösung
5 % Magermilchpulver in H2O lösen und filtrieren, im Kühlschrank max. 3 Tage aufbewahren
• 2 x TBS-Lösung
Tris/HCl 9,16 g
NaCl 35,1 g
mit H2O ad 2000 ml
• TBST-Lösung
1 ml Tween-20 auf 1000 ml TBS-Lösung 4.3.5 Tissuemicroarray
Tissuemicroarrays (TMAs) aus Geweben des Nierenzellkarzinoms (RCC) wurden am Institut für Pathologie der Universität Erlangen von Prof. Dr. Arndt Hartmann et al. angefertigt. Eine ge-naue Beschreibung zur Generierung von TMAs wurde von Bubendorf et al. publiziert [12]. Die Kohorte umfasste 249 RCC Patienten, davon waren 145 männlich, 83 weiblich und bei 21 war das Geschlecht unbekannt. Das durchschnittliche Alter bei Diagnosestellung war 62 Jahre (19–88).
Die Proben wurden als 80 klarzellige, 66 papilläre, 73 chromophobe RCCs und 30 Oncocytome klassifiziert.