A. Gelzusammensetzung der SDS-PAGE:
3.4. Einfluss der N-terminalen Region des Prionproteins auf seine Aggregation
3.5.3. Proteinase K Resistenz des β-Strands S2 und der Helix 1 in fibrillärem humPrP23-173
Das Segment 160-173 des humanen Prionproteinfragmentes humPrP23-173 mit dem β-Strand S2 führte zu einer sehr starken Beschleunigung der Aggregation des Proteins. Damit war annähernd das komplette im PrPSc-Strukturmodell umfaltende Segment 90-175 in humPrP23-173 enthalten (Govaerts et al., 2004). Nach dem Modell wäre zu erwarten, dass die Region 90-173 in eine linksgewundene parallele β-Helix umfaltet, die relativ stabil gegenüber proteolytischem Verdau durch die Proteinase K sein sollte. Die Helices 2 und 3 sind gemäss der bekannten PrPSc-Strukturmodelle für die Konversion des Prionproteins nicht bedeutsam (Govaerts et al., 2004; Huang et al., 1996; DeMarco & Daggett, 2004). Durch einen Proteinase K-Verdau von fibrillärem humPrP23-173 sollte das PrPSc-Strukturmodell überprüft werden. Falls nur die Region 90-175 für die Umfaltung des zellulären Prionproteins in die Proteinase K-resistente PrPSc-Form verantwortlich sein sollte, dann würde das rekombinante fibrilläre PrP23-173 zumindest eine deutlich höhere Proteinase K Resistenz als das fibrilläre humPrP23-144 und humPrP23-159 aufweisen.
In der SDS-PAGE von Proteinase K verdautem fibrillärem humPrP23-173 wurden zwei Fragmente mit einem Molekulargewicht von etwa 8 kDa bzw. 6-7 kDa sichtbar, die eine Grösse vergleichbar zu Proteinase K verdautem humPrP23-159 bzw. humPrP23-144 aufwiesen (Abb. 24 A).
A B
C D
Abb. 24: Überprüfung der Proteinase K Resistenz des β-Strand S2 und der Helix 1 in fibrillärem humPrP23-173. (A) SDS-PAGE von monomerem (M) und Proteinase K verdautem fibrillärem (Fibrillär) humPrP23-144, humPrP23-159 und humPrP23-173 bei Proteinase K Konzentrationen von 50 µg/ml und 100 µg/ml in einer speziellen SDS-PAGE, die für die Auftrennung von Aβ-Peptiden mit nur einer Aminosäure Unterschied entwickelt wurde (Wiltfang et al., 2001). Die aufgetragenen Proteinmengen pro Spur betrugen je 5 µg der monomeren Proteine und je 30 µg der Proteinase K verdauten fibrillären Prionaggregate. (B) Western Blot von monomerem (M) und fibrillärem (F) Proteinase K verdautem (100 µg/ml Proteinase K, 37 °C, 1 h) humPrP23-144, humPrP23-159 und humPrP23-173 mit dem Antikörper 3B5 (C) Western Blot von monomerem (M) und fibrillärem (F) Proteinase K verdautem humPrP23-173, humPrP23-159 und humPrP23-144 mit dem Antikörper 1E4. (D) Western Blot von monomerem (M) und fibrillärem (F) Proteinase K verdautem humPrP23-144, humPrP23-159 und humPrP23-173 mit dem Antikörper 6H4. Nur monomeres humPrP23-173 und monomeres humPrP23-159 wurden vom 6H4 Antikörper erkannt.
Western Blots der Proteinase K verdauten fibrillären Strukturen von humPrP23-173 mit den Antikörpern 3B5 (Motiv 59-89) (Abb. 24 B) und 1E1 (Motiv 98-109) (Abb. 24 C) zeigten, dass die N-terminale Startsequenz des Proteinase K resistenten Fragmentes von humPrP23-173 zwischen den Bindungsmotiven der beiden Antikörper 1E4 und 3B5 analog zu humPrP23-159 und humPrP23-144 lag. Ein zum PrPSc-Typ 1 analoges Spaltungsmuster konnte auch hier ausgeschlossen werden (Abb. 24 B, C). Das aus der SDS-PAGE (Abb. 24 A) durch Vergleich mit dem Laufverhalten der Markerproteine abschätzbare Molekulargewicht des Proteinase K resistenten Fragmentes von humPrP23-173 schien dem Molekulargewicht von Proteinase K verdautem humPrP23-159 zu entsprechen.
Durch Western Blots mit dem an die Helix 1 Region bindenden Antikörper 6H4 (Motiv 144-152) konnte gezeigt werden, dass Proteinase K verdautes fibrilläres humPrP23-173 kein Helix 1-Segment und auch keinen β-Strand S2 mehr enthält (Abb. 24 D).
Ein Fragment von der Grösse des Segmentes 160-173 (1.8 kDa) konnte in der SDS-PAGE (Abb. 24 A) nicht detektiert werden.
Neben dem qualitativen Nachweis der Helix 1 und des Segmentes 160-173 mit dem β-Strand S2 in den Proteinase K verdauten Prionproteinfragmenten wurde auch eine quantitative Analyse der Proteinase K verdauten Fragmente durchgeführt (Abb. 25). Die Annahme bei der Berechnung der Stoffmengenkonzentration war, dass das Proteinase K-resistente Fragment von fibrillärem humPrP23-144 der Region 97-144 und die Proteinase K verdauten Fragmente von fibrillärem humPrP23-159 und humPrP23-173 jeweils der Region 97-146 entsprechen.
Nach chromatographischer Aufreinigung der Fragmente ergab eine Proteinkonzentrationsbestimmung aus drei unabhängigen Experimenten ein molares Verhältnis von etwa 5 : 1 : 2.5 für humPrP23-144 : humPrP23-159 : humPrP23-173. Es ist anzumerken, dass auch ein hypothetisch Proteinase K-resistenter Bereich der Aminosäuren 97-159 in fibrillärem humPrP23-159 und humPrP23-173 die vorhandene Tendenz nur noch verstärkt hätte. Es würde sich ein molares Verhältnis von etwa 7 : 1 : 2.5 für humPrP23-144 : humPrP23-159 : humPrP23-173 ergeben. Die eingesetzten Stoffmengenkonzentrationen der fibrillären Prionproteinaggregate für den Proteinase K-Verdau waren jeweils identisch.
Danach war die Region 97-144 bezogen auf die eingesetzten Proteinmengen das gegen die Proteinase K deutlich resistenteste Fragment. Eine Verlängerung der Proteinsequenz von humPrP23-144 um das Helix 1-Segment reduzierte die Proteinase K Resistenz der gebildeten fibrillären Aggregate von humPrP23-159 im Vergleich zu fibrillärem humPrP23-144 deutlich.
Vergleich zu fibrillärem humPrP23-159, ohne jedoch die Resistenz von fibrillärem humPrP23-144 gegenüber proteolytischem Abbau zu erreichen.
Erwartete Fragmentgrössen nach PK-Verdau PrP97-146 PrP97-144
Reisolierte Prionproteinfragmente nach PK-Verdau (%)
0 10 20 30 40 50 60
Abb. 25: Quantitative Analyse der Proteinase K (PK)-verdauten fibrillären Prionproteine. Je 0.2 µmol der fibrillären Prionproteine humPrP23-144 (schwarz), humPrP23-159 (rot) und humPrP23-173 (grün) wurden für je 1 h, 37 °C mit 100 µg/ml Proteinase K bei 1400 rpm im Eppendorf-Thermoshaker verdaut und anschliessend chromatographisch reisoliert. Die Balken geben die reisolierten Stoffmengenkonzentrationen in Prozent relativ zur eingesetzten Stoffmengenkonzentration an. Die Berechnung der Stoffmengenkonzentration basierte für humPrP23-159 und humPrP23-173 auf einer Fragmentgrösse (PrP97-146), die auf der Edman-Sequenzierung von humPrP23-144 und humPrP23-159 (Abb. 16 B) und einer Grössenabschätzung der Proteinase K verdauten Fragmente aus der SDS-PAGE (Abb. 24 A) beruhte. Die Fragmentgrösse von Proteinase K verdautem humPrP23-173 wurde basierend auf dem N- und C-terminalen Epitop-Mapping bei identischem Laufverhalten als identisch zu Proteinase K verdautem humPrP23-159 angenommen.
Zusammenfassend konnte als Ergebnis des Proteinase K-Verdaus von fibrillärem 173 gezeigt werden, dass die Proteinase K verdauten Fragmente von fibrillärem humPrP23-159 und fibrillärem humPrP23-173 eine wahrscheinlich sehr ähnliche oder identische Proteinsequenz aufweisen. Durch einen Verdau des Helix 1-Segmentes in humPrP23-173 wurde auch die Region 160-173 vom Rest des Moleküls abgespalten. Eine Aussage über die Proteinase K Resistenz des Segmentes 160-173 in humPrP23-173 ist aufgrund der geringen Grösse des Spaltfragmentes und einem Fehlen von spezifischen Antikörpern gegen diese
Region unsicher. Die Anwesenheit des β-Strands S2 führte nicht zu einer ähnlich hohen Proteinase K Resistenz der kompletten Region 90-173 wie im pathologischen Prionprotein.
Allerdings führte die Existenz der Region 160-173 zu einer Erhöhung der Proteinase K Resistenz der Region 97-146 in humPrP23-173 gegenüber humPrP23-159, womit offensichtlich nicht alle Proteinaggregate trotz gleicher Fragmentlänge eine identische Resistenz gegenüber proteolytischem Verdau aufweisen.
Eine massenspektrometrische Analyse der Proteinase K verdauten Fragmente war aufgrund ihrer Unlöslichkeit unter nicht-denaturierenden Bedingungen nicht möglich.
In der vorliegenden Arbeit wurde in einem physiologischen Konversionsassay der Einfluss der Helix 1 und des β-Faltblattes auf die Aggregation des Prionproteins untersucht. In der folgenden Diskussion werden die Bedeutung physiologischer Bedingungen für die Umfaltung des Prionproteins, der Einfluss des pH-Wertes, der Mechanismus der Umfaltung und die aus den hier erzielten Ergebnissen abgeleitete Struktur des pathologischen Prionproteins dargestellt.
4.1. In vitro Modell zur Simulation konformativer Änderungen des humanen