3.11.1 Protein-Mengenbestimmung nach Bradford (quantitativ)
Um die Proteinmenge in einem Zell-Lysat anhand des Bradford-Test (Biorad) zu ermitteln, musste zuerst eine Eichkurve mit Hilfe bekannter BSA Mengen (1–7 mg/ml) erstellt werden.
Hierzu wurden je 2 µl der BSA-Lösung zu 800 µl H2O und 200 µl Bradford-Reagenz gegeben. Nach 10 min Inkubation konnten die Eichpunkte spektrophotometrisch ermittelt werden. Als Referenz diente hier die Absorption eines 1:5 verdünnten Bradford-Reagenz. Der Koeffizient zur Bestimmung der Proteinkonzentration ergibt sich aus der Konzentration der Eichpunkte dividiert durch die Absorption bei OD 595 nm. Zur Protein-Mengenbestimmung eines Lysats wurden 2 µl hiervon zu 800 µl H2O und 200 µl Bradford-Reagenz gegeben.
Nach einer Inkubationszeit von ungefähr 10 min wurde anhand der Absorption bei OD 595 nm und dem Eichkurvenkoeffizienten der Proteingehalt bestimmt.
3.11.2 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) von Proteinen
Die Auftrennung von Proteinen in einem SDS-Polyacrylamidgel erfolgt ausschließlich nach ihrem Molekulargewicht. Hier wird in Abwandlung zu Laemmli [110] zusätzlich ein diskontinuierliches Puffersystem eingesetzt, um eine verbesserte Auftrennung zu erreichen.
Das SDS-Gel besteht je nach Größe der Proteine aus einem 7-12 % Trenngel und einem 4 % Sammelgel (Zusammensetzung der Gele siehe Materialteil). Das Gießen der Gele erfolgte in einer Proteingelkammer der Firma BioRad (München). Um eine gerade Trennlinie zwischen Sammel- und Trenngel zu erlangen, wurde letzteres sofort nach dem Gießen mit 1 ml Isopropanol überschichtet. Nach erfolgter Polymerisation des Trenngels, wurde der Alkohol gründlich entfernt und das Sammelgel gegossen. Auspolymerisierte SDS-Gele konnten in
Methoden
feuchten Tüchern und Frischhaltefolie bei 4°C gelagert werden. Vor dem Auftragen wurden alle Proteinlysate mit 1 x Laufpuffer versetzt und nochmals für 4 min bei 99°C gekocht. Die Auftrennung erfolgte bei 20 mA in 1 x Laufpuffer, wobei die Dauer der Elektrophorese der gewünschten Trennung angepasst wurde.
3.11.3 Coomassie-Färbung von SDS-Polyacrylamidgelen
Eine Anfärbung der SDS-Gele erfolgte für mindestens 20 min in Coomassie-Färbelösung.
Nach Entfernen der Färbelösung wurde das Gel kurz in Wasser geschwenkt und solange mit Entfärberlösung behandelt, bis die Proteinbanden gut sichtbar waren. Die angefärbten Banden konnten nun zwischen zwei Klarsichtfolien gescannt werden. War das SDS-Gel mit radioaktiv markierten Proteinen (35S, 14C) beladen, so wurde es nach dem Entfärben nochmals 30 min mit Amplify (Amersham) behandelt. Die Trocknung der Gele erfolgte bei 80°C je nach deren Größe für 20–60 min in einem Vakuumtrockner der Firma Hoefer.
3.11.4 Western Blot Analyse
Die in einem SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennten Proteine, wurden durch das Semi-Dry-Blot-Verfahren (BioRad, München) auf eine Protean-Nitrocellulosemembran (Schleicher &
Schüll) übertragen. Der Aufbau des Blots gestaltete sich folgendermaßen: Anode – 3 x 3MM-Papier – Nitrocellulosemembran – SDS-Polyacrylamidgel – 4 x Whatman-3MM-Papier – Kathode. Das Whatman-Papier, das Gel und die Nitrocellulosemembran wurden zuvor in Transferpuffer äquilibriert. Der Transfer erfolgte zuerst für 10 min bei 10 V und anschließend je nach Proteingröße für 20–40 min bei 20 V. Zur Absättigung unspezifischer Antikörperbindungsstellen (Blocken), wurde die Membran für 1 h in 10 % Milchpulver (gelöst in TBS) inkubiert. Über Nacht erfolgte die Inkubation mit einem primären Antikörper bei 4°C auf einer Wippe. Die Antikörper wurden je nach Herstellerangaben bzw. nach Austestung, in 5 % Milchpulver/TBS/0,05 % Tween verdünnt.
Die Inkubation mit einem Peroxidase-konjugiertem Sekundärantikörper erfolgte in 5 % Milchpulver/TBS/0,05 % Tween bei Raumtemperatur für eine Stunde. Nach erneuten Waschschritten in TBS/0,05 % Tween (3 x 30 min) wurden die Antikörper-beladenen Proteine mittels Chemilumineszenz visualisiert. Hierzu wurde entweder eine frisch hergestellte Entwicklerlösung oder ein sensitiver ECL-Kit der Firma Pierce verwendet. Das entstehende Lichtsignal wurde mittels Autoradiographie nach verschiedenen
Methoden
Die Membran konnte nach erneutem Blocken zur Detektion mit einem anderen spezifischen Antikörper wieder verwendet werden, wobei die Block-Lösung nun Natriumazid enthielt, um die Peroxidase der gebundenen Sekundärantikörper zu inaktivieren.
3.11.5 Immunpräzipitation von Proteinen aus adhärenten Zellen
Die Zellen wurden zunächst in kaltem PBS mit einem Zellschaber von der Platte abgeschabt und bei 2.500 Upm (600 xg), 4°C für 3 min zentrifugiert. Nach einmaligem Waschen mit PBS wurde das Zellpellet in 300 µl RIPA-Puffer (0,1 % SDS, Proteaseinhibitoren) gleichmäßig resuspendiert. Die Zell-Lyse erfolgte für 30 min auf Eis. Anschließend wurde das Lysat bei 16.000 Upm (24.000 xg) und 4°C für 15 min abzentrifugiert und der Überstand zu 40 µl Protein A-Sepharose gegeben. Durch eine Inkubation von 1 h bei 4°C auf einem Drehrad, wurden unspezifisch Sepharose bindende Proteine aus dem Lysat entfernt. Der Überstand wurde nach einem erneuten Zentrifugationsschritt (1.000 Upm/100 xg, 4°C, 1 min) zur Protein-Mengenbestimmung nach Bradford verwendet. Nachdem alle Proben auf gleiche Proteinkonzentrationen und Volumina (mit RIPA-Puffer) eingestellt worden waren, konnte der spezifische Antikörper (1:100) hinzugefügt werden. Während einer Inkubation über Nacht bei 4°C auf dem Drehrad binden die Proteine spezifisch an den Antikörper, sodass anschließend die eigentliche Kopplung des Antikörpers an 40 µl Protein A-Sepharose erfolgen konnte. Hierzu wurde das Antikörper/Protein/Protein A-Sepharose Gemisch für eine weitere Stunde auf dem Drehrad bei 4°C inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit 1 ml RIPA-Puffer, wurden die Sepharose-Beads mittels einer Hamiltonspritze trocken gesaugt, mit 50 µl 2 x SDS-Probenpuffer versetzt und bei 99°C für 5 min aufgekocht. Im Anschluss erfolgte die Auftrennung der Proteine im SDS-PAGE und der Nachweis dieser durch Autoradiographie.
3.11.6 p24 Antigen Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Mit Hilfe dieses Assays konnte im zellfreien Kulturüberstand HIV-infizierter Zellen die Konzentration des p24-Kapsidproteins bestimmt werden. Zur Inaktivierung von infektiösen Virusüberständen wurden die Proben mit 10 % SPDL bzw. 10 % Triton X-100 (Stock 5 %) versetzt (z.B. 50 µl Inaktivierungslösung + 450 µl Virusüberstand).
Es handelt sich hierbei um ein Sandwich-ELISA, bei welchem zuerst ein gegen das p24-Kapsidprotein gerichteter Antikörper (mα183) auf eine Flachbodenplatte mit 96 Vertiefungen (Immuno Plate, MaxiSorp Surface) gebunden wurde. Hierzu wurden pro Platte 200 µg mα183
Methoden
in 10 ml PBS verdünnt und zu je 100 µl pro Vertiefung aufgetragen. Nach einer Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer, erfolgte ein dreimaliger Waschschritt mit je 200 µl PBS/0,05 % Tween pro Vertiefung. Zur Beseitigung von unspezifischen Antikörperbindungsstellen, erfolgte im Anschluss eine 2 h Inkubation bei 37°C mit je 200 µl PBS/10 % NKS pro Vertiefung. Nach drei weiteren Waschschritten (200 µl PBS/0,05 % Tween) wurden die inaktivierten Zellkulturüberstände in geeigneten Verdünnungen zu je 100 µl pro Vertiefung auf die beschichteten Platten aufgetragen. Analog wurde ein Standard mit definierten Kapsidmengen (4-0,0625 ng, Duplikate) aufgetragen.
Während einer weiteren Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer, konnten die Kapsidproteine spezifisch an den Erstantikörper binden. Nach drei weiteren Waschzyklen mit PBS/0,05 % Tween wurde ein weiterer gegen das Kapsidprotein gerichteter Antikörper (rαCA) zugegeben. Pro Platte wurden hier 10 ml 10 % NKS (in PBS) mit 100 µl PBS/10 % Tween und 10 µl rαCA gemischt und 100 µl in jede Vertiefung pipettiert. Nach einer 1 h Inkubation bei 37°C, wurden ungebundene Antikörper durch erneutes Waschen (s.o.) entfernt. Anschließend erfolgte eine weitere Inkubation (1 h, 37°C) mit einem anti-rabbit-Peroxidase Antikörper. Von diesem wurden pro Platte 5 µl in 10 ml 10 % NKS und 100 µl PBS/10 % Tween gelöst und 100 µl pro Vertiefung aufgetragen. Nach erneutem Waschen wurde die Platte mit entionisiertem Wasser geflutet und trocken geklopft.
Durch Zugabe von 100 µl Tetramethylbenzidin-Lösung pro Vertiefung (TMB; 10 ml 0,1 M Natriumacetat-Puffer pH 6,0; 100 µl TMB (Stock 10 mg/ml DMSO); 2µl H2O2) wurde die Peroxidase in einen blauen Farbstoff umgesetzt. Nach 5 min erfolgte der Reaktionsstopp mit 50 µl 0,5 M Schwefelsäure pro Vertiefung, was zu einem sofortigen Farbumschlag von blau nach gelb führte. Die Extinktion konnte anschließend bei OD 450 nm/560 nm in einem ELISA-Lesegerät gemessen werden.
Zur Bestimmung der p24-Antigenkonzentrationen aus den Extinktionswerten, wurde mittels der Eichgeraden eine Regressionsgleichung erstellt. Dadurch konnten die Extinktionswerte unter Einbeziehung des Verdünnungsfaktors bestimmten p24-Antigenkonzentrationen (ng/ml) zugeordnet werden.
Methoden