Prüfung der Öl-Extraktionsmethode

Neben der Untersuchung des Pistazienkerns im Ganzen wurde auch von allen Proben das Pistazienöl und der nach der Extraktion verbleibende entfettete Rückstand auf die Isotopen-verhältnisse hin untersucht. Hierdurch soll in der späteren statistischen Auswertung geklärt werden, ob eine Verschärfung der Trennung der Herkunftsländer aufgrund von Sekundär-stoffwechselvorgängen in der Pflanze in den Messwerten auftritt. Bei der Auswahl des Verfah-rens zur Gewinnung des Öls und des entfetteten Rückstands wurde in erster Linie darauf ge-achtet, dass es diskriminierungsfrei arbeitet, denn sonst wird das Stabilisotopenverhältnis stark verfälscht. Da sehr viele Proben aufgearbeitet werden mussten, sollte die Aufarbei-tungsmethode außerdem einfach, schnell und automatisierbar sein.

60 Bundesinstitut für Risikobewertung 5.6.1 Diskriminierungsstudie anhand der Soxhletmethode

Durchführung:

Zur Sicherstellung einer diskriminierungsfreien Extraktion des Pistazienöls wurden zwei Haus-haltsöle einer Soxhlet-Extraktion mit Petrolbenzin^[209] unterzogen und die Stabilisotopendaten vor und nach der Extraktion gemessen.

Ergebnis:

Tab. 23: Vergleich der δδδδ-Werte zweier Öle vor und nach Soxhlet-Extraktion δ¹³CPDB

Öl 1 δ¹⁸OVSMOW

Öl 1 δ¹³CPDB

Öl 2 δ¹⁸OVSMOW

Öl 2

xvor der Extraktion -27,5 ‰ 22,4 ‰ -13,3 ‰ 20,8 ‰

xnach der Extraktion -27,5 ‰ 22,9 ‰ -13,3 ‰ 21,2 ‰

Kritische Grenze CD*

|xvorher-xnachher| ≤ CD

Kein

Unterschied nvor=4, nnach=6 0,5 ≤ 0,5

Kein

Unterschied nvor=5, nnach=5 0,4 ≤ 0,5

*Zur Berechnung der kritischen Grenze CD zwischen zwei Werten s. Anhang I: Statistische Grundformeln

Aus der Ergebnistabelle 23 ist zu entnehmen, dass keine Diskriminierung durch das Extrakti-onsverfahren nach Soxhlet bei der ¹³C-Messung zu beobachten ist, denn die Mittelwerte vor und nach der Extraktion beider Öle sind gleich.

Obwohl die Mittelwerte beim Sauerstoffisotop vor und nach der Extraktion differieren, konnte auch hier statistisch keine Diskriminierung durch die Soxhlet-Extraktion festgestellt werden.

Hierzu wurde der Vergleich mit der kritischen Grenze herangezogen, der zeigt, dass die Mit-telwerte um einen von der Methodenpräzision her zulässigen Betrag differieren. Die Ölextrak-tionsmethode nach Soxhlet arbeitet somit diskriminierungsfrei und ist für die Isotopenanalytik geeignet. Dies war auch zu erwarten, da die Wirkungsweise einer Flüssig-Flüssig-Extraktion auf der Chemie der Moleküle beruht und nicht auf deren physikalischen Eigenschaften, die verantwortlich für kinetische und thermodynamische Isotopeneffekte sind (siehe Kapitel 4.2).

Auch andere Autoren haben schon eine Diskriminierungsfreiheit für die Flüssig-Flüssig-Extraktion festgestellt.^[11,28,54]

5.6.2 Vergleich der Soxhlet-Methode mit der ASE

Die Extraktionsmethode nach Soxhlet ist eine traditionelle, validierte Methode, um Fett aus verschiedensten Lebensmitteln diskriminierungsfrei (s. vorheriges Kapitel 5.6.1) zu extrahie-ren.^[38] Die Soxhlet-Extraktion war jedoch unter den gegebenen Laborbedingungen nicht au-tomatisierbar, daher sollte die Ölextraktion aus den Pistazien auf die vollautomatische Extrak-tion mit der ASE-Technik (Accelerated Solvent ExtracExtrak-tion) umgestellt werden. Da dem Soxh-letverfahren schon Diskriminierungsfreiheit nachgewiesen wurde, musste eine ASE-Methode erstellt werden, die quantitativ vollständig extrahiert und gleiche Ergebnisse wie das Soxhlet-verfahren liefert.

Durchführung:

Eine Pistazienprobe wurde parallel nach Soxhlet und mit einer optimierten ASE-Methode ext-rahiert und die gewonnenen Öle und entfetteten Rückstände auf ihre Gleichheit in den C-, N- und O-Stabilisotopenverhältnissen hin überprüft.

Bundesinstitut für Risikobewertung 61 Ergebnis:

Tab. 24: Vergleich der δδδδ-Wert-Ergebnisse nach der Extraktion mit der Soxhlet- und der ASE-Methode δ¹³CPDB

*Zur Berechnung der kritischen Grenze CD zwischen zwei Werten s. Anhang I: Statistische Grundformeln

Der Vergleich der Mittelwertdifferenzen mit der jeweiligen kritischen Grenze CD zeigt (s. Tabelle 24), dass die Stabilisotopenverhältnisse der extrahierten Öle und entfetteten Rück-stände nur um einen methodenpräzisionszulässigen Wert schwanken. Damit unterscheiden sich die mit dem ASE-Verfahren ermittelten δ-Werte nicht von denen aus der Soxhletextrakti-on. Das ASE-Verfahren zur Gewinnung von Pistazienöl und dem entfetteten Rückstand arbei-tet somit auch diskriminierungsfrei und ist als Probenaufarbeitungsmethode für die IRMS ge-eignet.

5.6.3 Wiederholbarkeit der Extraktionsmethode

Die Ölextraktionsmethode mit der ASE muss auf ihre Wiederholbarkeit hin überprüft werden, um den Fehlerbeitrag der Aufarbeitung zur Gesamtmethode abschätzen zu können.

Durchführung:

Eine Pistazienprobe wurde sechsmal mit der ASE extrahiert und die gewonnenen Öle und entfetteten Rückstände auf ihr ¹³C-, ¹⁵N- und ¹⁸O-Isotopenverhältnis hin fünffach vermessen.

Ergebnis:

Tab. 25: Ergebnisse des Vergleichs der Mittelwerte (n = 5) von sechs ASE-Extraktionen einer Pistazienpro-be fett Ausreißer nach zweiseitigem Grubbs-Test (P = 95 %) und durch die Post-Hoc-Tests erkannter Verursacher

eines signifikanten Mittelwertunterschieds (p < 0,05) bei der ANOVA ⇒ Werte wurden in die weiteren Be-rechnungen nicht mit einbezogen.

* Test auf Homogenität der Varianzen nach Levene, Vergleich der Mittelwerte mittels einfaktorieller ANOVA (P = 95 %) und Post-Hoc-Mehrfachvergleiche nach Scheffé, Tukey und LSD

62 Bundesinstitut für Risikobewertung Die Messwerte des Öls der Extraktion 4 wurden aus den statistischen Berechnungen heraus-genommen, weil sie mit dem zweiseitigen Grubbs-Test (s. Anhang I: Statistische Tests) als Ausreißer erkannt wurden. Hier scheint ein Fehler nach der Extraktion gemacht worden zu sein, da nur das Öl und nicht der Rückstand betroffen ist. Dies kann z.B. durch Eintrag einer Verunreinigung beim Trocknen oder Umfüllen passiert sein.

Abgesehen von diesem Ausreißer beim Öl, ergibt sich aus den Mittelwerten der ¹³C-, ¹⁵N- und

18O-Messung der Rückstände wie auch der Öle, dass keine signifikanten Unterschiede zwi-schen den sechs Extraktionen bestehen, d.h. mit 95 %iger Wahrscheinlichkeit gehören diese Werte zu einer Grundgesamtheit.

Die Wiederholstandardabweichungen sr (Versuch) der Extraktionen liegen zudem in der glei-chen Größenordnung wie die im Rahmen der In-House-Validierung ermittelten Wiederholstan-dardabweichungen sr (Labor) (s. Kapitel 5.5.2). Die Abweichungen zwischen den sechs Ex-traktionen sind somit nicht größer als die Methodenpräzision zulässt und die Reproduzierbar-keit der Extraktion mit der ASE-Technik zur Gewinnung des Pistazienöls und des entfetteten Rückstands ist daher gegeben.