Population based studies on DRC and detection of influences caused by UV radiation using Host Cell Reactivation assay caused by UV radiation using Host Cell Reactivation assay

HCRA can be used to determine effects in answer to environmental influences. UV

irradiation is one of the most relevant risk factors for the development of skin cancer, such as basal- and squamous cell carcinoma or lentigo malignant- and superficial spreading

melanoma (for review see [154]). Using HCRA we have analyzed the influence of low dose UV irradiation. We could show that very low doses of UV increase DRC providing further evidence for a photoadaptive response. This finding is consistent with the results presented by other groups obtained by different assays systems [96,97,155,156].Gene expression analysis done after low dose UV irradiation showed an increased expression of XPC

providing a clue that not only TCR but also GGR can be induced by low dose UV irradiation.

Therefore we agree with Sheehan and colleagues who pinpointed that the stimulation of DNA repair by regular low level UVR exposure may be an important factor to consider in risk assessment and public health campaigns [157].

Individual susceptibility to cancer may result from host factors including differences in

metabolism, DNA repair, altered expression of protooncogenes and tumor suppressor genes, and nutritional status as described by Bartsch et al. [158]. He suggested that determination of metabolic at risk genotypes in combination with levels of DNA adducts in target (surrogate) tissues and the p53 mutation pattern should allow the identification of susceptible individuals and subgroups in carcinogen-exposed populations. Within the framework of human

population monitoring studies conducted to determine if exposure to environmental

mutagenic agents can cause health problems or not, DRC is also discussed as a predictive biomarker to identify cancer susceptibility. Low DRC has been linked with an increased risk for breast carcinoma [56], an increased probability to develop multiple basal cell carcinoma after overexpostion to sunlight [159,160], an increased risk of lung cancer [161] and to be an independent risk factor for susceptibility to sunlight-induced cutaneous malignant melanoma among the general population [59]. Additionally, interindividual variations in the expression of NER genes and proteins have been linked with a higher risk of lung cancer [162] as well as with a higher risk of endometrial cancer [163] and a higher risk for squamous cell carcinoma of head and neck [164]. The identification of high risk groups by population based studies could contribute to the development of specific early diagnosis programs ameliorating the prognosis of a specific cancer disease. However, reliable affordable and less-time

consuming assay systems to determine DRC are necessary.

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6 Summary

The human genome provides the basis for reproduction, proper development and correct functioning of the whole organism. Despite this, DNA is constantly under attack of damaging chemical or physical influences. These extrinsic influences as well as intrinsic processes give rise to DNA damages possibly ending in mutations during replication.

In the course of evolution several highly specialized repair pathways have evolved to counteract DNA damages and therefore preserve the integrity of the genome. The importance of repair pathways is impressively illustrated by rare repair disorders like

Xeroderma Pigmentosum. Affected individuals possess severely limited nucleotide excision repair and therefore show a 1000-fold increased cancer risk. For this reason, DNA repair pathways are promising targets with regard to the development of protective agents as well as with regard to the identification of potentially harmful substances.

The importance of influences on repair pathways is reflected by an OECD test guideline, published in 1997 describing the UDS repair assay in the context of DNA damages and repair to determine genotoxic properties.

Aim of this study was to establish a considerably more sensitive, reproducible,

non-radioactive assay to determine influences on NER capacity. This assay should neither afford an inhibition of replication nor exogenous impairment of the cell population. It should be suitable for studying biocompatibility/genotoxicity as well as for screening for possible active ingredients.

Within the framework of cooperation with an industrial company we established a host cell reactivation assay to determine the repair capacity of primary skin cells meeting the claims made. The utilization of different primary skin cells derived from a single skin biopsy poses a challenge particularly with regard to isolation, maintenance and transfection procedures. For the first time fluorescence activated cell sorting was used for repair capacity analysis

providing a single cell based interpretation of large cell populations which is reflected in an increased sensitivity. This method was published under the title >>A modified host cell reactivation assay to determine the repair capacity of primary human keratinocytes, melanocytes and fibroblasts<< (Burger et al.).Using this method, we showed a negative influence of Cyclosporin A on the NER of skin cells, providing a clue for the involvement of NER in enhanced cancer risk following Cyclosporin A therapy. Several other studies corroborate this believe.

In addition we demonstrated a negative influence of folic acid depletion on the repair capacity skin cells in a study involving 17 donors. Each individual showed a considerable decline of repair capacity following folic acid depletion. The results of this study were published under the title >>The influence of folic acid depletion on the nucleotide excision repair capacity of human dermal fibroblasts measured by a modified host cell reactivation assay<< (Burger et al.)

One further study concerned the influences of low dose UV radiation on the DNA repair capacity. We detected a significant increase of NER capacity following preirradiation of the cell populations with very low UV doses. This effect couldn’t be boosted by further low dose irradiations at intervals of 24 h. In the context of this study, we additionally analyzed

alterations of the gene expression pattern of different NER genes following low dose UV radiation. The results of this study were summarized to a manuscript titled >>Low doses of UVB enhance reactivation of UV damaged reporter gene in dermal fibroblasts<< (Burger et al.).

Taken together the new assay system to detect influences on DNA repair capacity implies a significant progress in the context of design and development of protective agents (screening for active ingredients) as well as in context of identifying negative influences on DNA repair capacity (detection of genotoxicity). This system provides potential for development as to higher throughput of potential agents and to influences on other repair pathways than nucleotide excision repair.

Declaration of authors contributions

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7 Zusammenfassung

Das menschliche Genom ist die Grundlage für Reproduktion, regelrechte Entwicklung und die Funktion des gesamten Organismus. Nichts desto trotz ist die DNA ständig

schädigenden Einflüssen physikalischer oder chemischer Natur ausgesetzt. Diese äußeren Einflüsse aber auch intrinsische Prozesse, führen zur Entstehung von DNA- Schäden, die im Zuge der Replikation zu Mutationen werden können. Im Laufe der Evolution haben sich teilweise hochspezialisierte Stoffwechselprozesse entwickelt um der Entstehung von Mutationen entgegenzuwirken und somit die Integrität des Genoms zu bewahren.

Wie wichtig die Rolle der Reparaturmechanismen ist, zeigt sich am Beispiel Xeroderma Pigmentosum, einer Krankheit, die durch Fehlen der Nukleotid Exzisions Reparatur (NER) gekennzeichnet ist und die ein mehr als 1000- fach erhöhtes Krebsrisiko verursacht. DNA Reparaturmechanismen sind daher ein wichtiges Target im Hinblick auf die Entwicklung protektiver Wirkstoffe sowie im Hinblick auf die Identifizierung potenziell schädlicher Agentien. Die OECD trägt dieser Bedeutung Rechnung, indem die UDS als Verfahren zur Bestimmung der Genotoxizität (DNA-Schäden und Reparatur) bereits 1997 in die

Testguidelines aufgenommen wurde.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines deutlich sensitiveren,

reproduzierbaren, nicht radioaktiven Assays zum Nachweis von Einflüssen auf die NER Kapazität. Der zu entwickelnde Assay sollte weder eine Inhibition der Replikation noch eine exogene Schädigung der Zellpopulation erfordern und sich sowohl für Untersuchungen im Hinblick auf Bioverträglichkeit/Genotoxizität als auch zum Wirkstoffscreening eignen.

Im Rahmen einer Industriekooperation konnte ein Host Cell Reactivation Assay zur

Untersuchung primärer Hautzellen etabliert werden, wobei die Verwendung verschiedener Zellen eines Spenders eine besondere zellkulturtechnische Herausforderung darstellte und hohe Ansprüche an das Transfektionsverfahren stellt. Die erstmals eingesetzte

durchflusszytometrische Analyse erlaubt eine einzelzellbasierte Auswertung großer

Populationen und somit eine deutliche Steigerung der Sensitivität. Die Methode wurde unter dem Titel: „A modified host cell reactivation assay to determine the repair capacity of primary keratinocytes, melanocytes and fibroblasts (Burger et al.) veröffentlicht. Unter Verwendung dieser Methode konnte gezeigt werden, dass Cyclosporin A einen negativen Einfluss auf die NER von Hautzellen hat, was eine Ursache für die stark erhöhte Hautkrebsinzidenz unter Cyclosporin A-Therapie sein könnte und im Rahmen von Untersuchungen an Leukozyten auch von anderen Gruppen gezeigt werden konnte.

Desweitern konnte im Rahmen einer Studie mit 17 Spendern verschiedenen Alters eindeutig nachgewiesen werden, dass sich ein Folsäuremangel negativ auf die Reparaturkapazität von Hautzellen auswirkt. Alle 17 untersuchten Spender zeigten eine deutliche Abnahme der Reparaturkapazität unter Folsäuremangel. Die Ergebnisse der Studie wurden unter dem Titel: „The influence of folic acid depletion on the nucleotide excision repair capacity of human dermal fibroblasts measured by a modified host cell reactivation assay“ (Burger et al) veröffentlicht. Im Rahmen einer weiteren Studie wurden die Einflüsse von niedrigen UV Dosen auf die Reparaturkapazität untersucht. Es zeigte sich eine signifikante Steigerung der Reparaturkapazität bereits bei sehr kleinen UV Dosen, die sich jedoch nicht durch weitere Bestrahlungen im Abstand von 24 h steigern lies. Zusätzlich wurde im Rahmen dieser Untersuchung Veränderungen im Genexpressionsmuster verschiedener NER Gene durch Bestrahlung mit niedrigen Dosen untersucht. Die Ergebnisse wurden zu einem Manuskript unter dem Titel „Low doses of UVB enhance reactivation of UV damaged reporter gene in dermal fibroblasts“ (Burger et al.) zusammengefasst. Insgesamt ergeben sich durch das neu entwickelte Assaysystem deutliche Fortschritte im Zusammenhang mit der Entwicklung protektiver Wirkstoffe (Wirkstoffscreening) und der Identifizierung negativer Einflüsse auf die Reparaturkapazität (Genotoxizitätsuntersuchungen). Das System besitzt

Entwicklungspotential im Hinblick auf höhere (Wirkstoff-) Durchsätze und Einflüsse auf andere Reparaturpathways.

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