Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

2.14.1 PCR an Plasmid-DNA

Die Methode wurde mit folgendem Reaktionsansatz durchgeführt:

x µl template-DNA (10–50 ng)

1 µl Primer 1 (10 pmol/µl, sequenzspezifisch) 1 µl Primer 2 (10 pmol/µl, sequenzspezifisch) 5 µl dNTPs (2 mM)

5 µl Taq-Polymerase Puffer (10 x) 0,7 µl MangoTaq-Polymerase (1U/µl) ad 50 µl dH₂O

Die DNA-Amplifikation erfolgte mittels 30-40 Zyklen in einem Primus 96 Thermocycler der Firma MWG Biotech (High Point, NC, USA). Die Anzahl der Zyklen, die einzelnen Temperaturschritte und die jeweilige Dauer der Zyklen mussten für jedes DNA-Fragment und

die dafür eingesetzten Primer neu gewählt werden. Ein Zyklus bestand aus folgenden Einzelschritten:

95°C 30–60 sec Denaturierung

50–65°C 30–90 sec Annealing

72°C 30–90 sec Elongation

Vor Beginn des ersten Zyklus wurde 1-3 min bei 95°C denaturiert. Nach Beendigung der gewünschten Zyklen schloss sich ein letzter Elongationsschritt von 7 min bei 72°C an.

1/10 Vol des Ansatzes wurde mit Stop-Mix II gemischt und je nach Größe des PCR-Produkts auf ein 1-1,5%iges Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt.

2.14.2 Reverse Transkription

Um eine repräsentative Population von cDNA aus Gesamt-RNA zu erhalten, wurde die Reverse Transkription mit SuperScript II (Invitrogen, Karlsruhe) und oligo(dT)-Primern, die mit den poly(A)⁺-Sequenzen der mRNA paaren, durchgeführt. Es entsteht ein sog. cDNA-Strang (für complementary DNA), der zur mRNA komplementär ist und später DNA-abhängigen DNA-Polymerasen zugänglich gemacht werden kann.

Für die Reverse Transkription wurden 2-5 µg RNA mit 1 µl oligo(dT)-Primer (0,5 µg/µl) und 1 µl dNTP (10 mM) in 12 µl Gesamtvolumen gemischt und 10 min bei 70°C inkubiert. Nach Zugabe von:

4 µl 5x First Strand buffer 2 µl DTT (0,1 M)

1 µl RNase-Inhibitor

wurde die Probe 2 min bei 42°C inkubiert und 1 µl SuperScript II hinzugefügt. Die Reverse Transkription wurde 50 min bei 42°C durchgeführt. Anschließend wurde bei 70°C für 15 min die Reverse Transkriptase inaktiviert.

2.14.3 Quantitative real time PCR-Analysen

Real time PCR bezeichnet ein PCR-Verfahren, bei dem während der PCR die Menge der entstandenen Produkte in Echtzeit gemessen wird. Die Messung der Produktzunahme geschieht anhand von Fluoreszenzlicht, welches in Abhängigkeit von der Produktmenge emittiert wird. Eine Möglichkeit zur Generierung produktabhängiger Fluoreszenz bieten dsDNA bindende Fluoreszenzfarbstoffe. Hier wurde der Cyaninfarbstoff SYBR®-Green I, welcher als QuantiTect SYBR®-Green PCR Master Mix von der Firma Qiagen (Hilden) vertrieben wird, verwendet. Der Farbstoff bindet weitgehend sequenzunspezifisch in der kleinen Furche doppelsträngiger DNA, mit einer etwa 100fach höheren Affinität als Ethidiumbromid. Das derart gebundene SYBR®-Green fluoresziert nach Anregung etwa 1000x stärker als der freie Farbstoff, weshalb SYBR®-Green sehr gut geeignet ist, die Akkumulation doppelsträngiger PCR-Produkte sichtbar zu machen [Morrison et al., 1998].

SYBR®-Green lässt sich in Gegenwart von doppelsträngiger DNA mit Blaulicht (480 nm) anregen und zeigt ein Emissionsspektrum mit einem Maximum bei 520 nm.

Die Analyse wurde im 384well-Maßstab mit dem „ABI Prism 7900T Sequence Detection System" durchgeführt. Dieses System arbeitet mit einem Temperatur-Cycler und einem Laser, der zu jedem der 384 Reaktionsansätze gelenkt wird und diese anregt. Über ein ladungsempfindliches Detektionssystem erfolgte die Messung der Fluoreszenz jeder Probe, die durch an dsDNA gebundenes SYBR®-Green emittiert wird. Die Daten wurden mit Hilfe der Sequenz-Detektionssystem-Software (SDS Version 2.1, PE Applied Biosystems) quantifiziert, exportiert und in Excel (Microsoft) ausgewertet. Die Reaktions-Ansätze enthielten je 0,25 µM der Oligonukleotide und 5 µl 2x QuantiTect™ SYBR®-Green PCR-Master-Mix (Qiagen, Hilden). Letzterer enthält die HotStarTaq™ DNA-Polymerase in einem optimierten Puffer, dNTP-Mix (mit dUTP-Additiv), den SYBR®-Green I Fluoreszenz-Farbstoff und ROX-Fluoreszenz-Farbstoff als passive Referenz. Der ROX-Fluoreszenz-Farbstoff soll die Korrektur minimaler Abweichungen erlauben, die durch Pipettier-Ungenauigkeiten oder Fluoreszenz-Schwankungen entstehen können.

Jedem Ansatz wurden entweder 25 ng genomische DNA (bei Kopienzahlbestimmung des Transgens; Endkonzentration 2,5 ng/µl) oder 2,5 µl 1:100 verdünnter cDNA (bei Bestimmung differentieller Genexpression) zugefügt. Für die Erstellung einer Standardkurve wurden Ansätze mitgeführt, die genomische DNA einer transgenen Maus der F1-Generation in den Endkonzentrationen 20 ng/µl, 10 ng/µl, 5 ng/µl, 2,5 ng/µl, 1,25 ng/µl und 0,625 ng/µl

enthielten. Um das Auftreten von unspezifischen Produkten auszuschließen, wurde nach Abschluss der Amplifikation eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt. Dabei wurde kontinuierlich die Fluoreszenz (F) bei steigender Temperatur (T) gemessen und die Steigung dF/dT (1. Ableitung) errechnet. Diese wurde gegen die Temperatur aufgetragen und damit die Maxima bei den primerspezifischen Schmelztemperaturen aufgezeigt. Zusätzliche Maxima verrieten unspezifische Produkte, z.B. Primer-Dimere. Folgendes Programm wurde für alle Primer verwendet:

50°C 2 min

95°C 15 min Aktivierung Taq

94°C 15 s Denaturierung

58°C 30 s 40 Zyklen Annealing

72°C 1 min 30 sec Elongation

95°C 15 s

60°C 15 s

60°C-95°C 2°C/min Schmelzkurve

Die relative Quantifizierung der initialen Kopienzahl erfolgt bei der real time PCR anhand des Verhältnisses der Kopienzahl des zu untersuchenden Testamplikons und eines Referenzamplikons, das unter identischen Bedingungen amplifiziert wird. Für die Genotypisierung wurde ein Pelota-spezifisches Primerpaar verwendet, da das Pelota-Gen genau eine Kopie im Mausgenom hat. Für die quantitativen Genexpressionsanalysen wurde als Referenz das housekeeping-Gen GAPDH (Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase) verwendet. Bei der Auswertung wird ein Signal-Schwellenwert definiert, bei welchem sich jede Einzelreaktion in der exponentiellen Phase befinden sollte. Der Zeitpunkt (in Zyklen), zu dem das Signal diesen Schwellenwert erreicht, wird als Schwellenwertzyklus oder CT-Wert (threshold cycle) bezeichnet. Dieser CT-Wert korreliert mit der Anzahl der Kopien, die für die Reaktion eingesetzt wurden. Wie in Abbildung 2.1 gezeigt, resultiert eine höhere oder niedrigere Start-Kopienzahl in einem signifikant früheren oder späteren Anstieg der Fluoreszenz-Emission.

Abb. 2.1: Zunahme der Fluoreszenz zweier Proben (A und B) in Abhängigkeit von der PCR-Zyklus-Anzahl. Probe A enthält eine größere Menge an Start-Kopien als Probe B und überschreitet den Schwellenwert daher bei einem früheren Zyklus als Probe A. CT: Schwellenwertzyklus. Quelle: QuantiTect SYBR®-Green PCR Handbook, Qiagen (2003).

Aus den Daten der Standardkurven für jedes Amplikon interpoliert das Programm SDS 2.1 die theoretisch eingesetzte DNA-Menge für Referenzamplikon und Testamplikon jeder Probe (cDNA oder Maus-DNA). Da für das Testamplikon und das Referenzamplikon einer Probe exakt gleiche DNA-Mengen für die Taqman-Analyse einsetzt werden, sollte das Verhältnis der durch das Programm interpolierten DNA-Menge von Testamplikon zu Referenzamplikon den Wert 1 ergeben. Im Falle einer homozygot transgenen Leupaxin-Maus, befindet sich doppelt soviel template-DNA für das Testamplikon wie für das Referenzamplikon in den Taqman-Ansätzen. Bei der Berechnung des Verhältnisses Testamplikon zu Referenzamplikon wird in diesem Fall ein Wert von ca. 2 erhalten.