Polymerase-Kettenreaktion

Die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaktion, PCR) dient der selektiven Vervielfältigung (Amplifizierung) eines Genabschnitts in vitro. Ausgehend von einem isolierten DNA-Extrakt wird hierbei nur ein bestimmtes, maximal etwa 3.000 Basenpaare (3 kbp) langes DNA-Fragment zyklisch amplifiziert.

Bei jeder PCR wurde neben den Patientenproben eine Negativkontrolle hinzugefügt, die anstatt der isolierten DNA Wasser enthielt. Mit Hilfe dieser Kontrolle lassen sich Kontaminationen mit fremder DNA bei der anschließenden Gel-Elektrophorese ausschließen. Der PCR-Prozess selbst besteht aus einer Anzahl von circa 30 Zyklen, wobei jeder bestenfalls eine Verdopplung der vorhandenen DNA-Menge bedeutet. Jeder einzelne Zyklus besteht hierbei aus drei Schritten:

1. Denaturierung („melting“)

Die isolierte Doppelstrang-DNA (dsDNA) wird auf 94-96 °C erhitzt, um die Einzelstränge, die durch Wasserstoffbrückenbindungen zusammengehalten werden, zu trennen.

2. Primerhybridisierung („primer annealing“)

Nach Auftrennung der DNA wird die Temperatur wieder gesenkt, so dass die für die gesuchte DNA-Sequenz spezifischen Primer an die Einzelstränge binden können. Diese Primer sind für das gesuchte DNA-Anfangsstück zum jeweiligen Einzelstrang komplementär („forward and revers primer“).

3. Elongation

Die zugesetzte hitzestabile Taq – DNA – Polymerase katalysiert nun die Verlängerung der von den Primern markierten DNA-Sequenzen mit freien Nukleotiden (Desoxynukleosidtriphosphat = dNTP). Sie beginnt am 3´-Ende des angelagerten Primers und folgt dann dem DNA-Strang wodurch ein komplementärer Strang hybridisiert wird. Die beiden Primer sind dabei so zu wählen, dass sie sich an Strang beziehungsweise Gegenstrang der zu amplifizierenden DNA-Sequenz anlagern. Die beiden Primer werden hierbei nicht wieder abgelöst und bilden den Anfang des neuen Einzelstrangs.

Durch Wiederholung dieses dreistufigen Zyklus ist eine expotentielle Amplifikation der gewählten DNA-Sequenz möglich. Zur Durchführung der PCR wurde ein Standard-Master-Mix erstellt. Dieser enthält alle für die Amplifizierung nötigen Substanzen und umfasste jeweils ein Gesamtvolumen von 25 μl, worauf 1 μl auf die isolierte DNA entfielen.

Ansatz Master Mix für 1 Probe:

• 10× Puffer 2,5 μl

• Primer sense 10,5 μl

• Primer Antisense 0,5 μl

• dNTPs 1,25 μl

• Taq-Polymerase 0,2 μl

• HPLC-H2O 19,05 μl.

Entspricht 24 μl des Master-Mix; dieser wird nun gut gemischt und anzentrifugiert.

Danach wird 1 μl des DNA-Templates (entspricht 50 ng) hinzugefügt. Die Negativ-Kontrolle wird mit 1 μl HPLC- H2O zum gleichen Gesamtvolumen von 25 μl aufgefüllt.

Primerstammlösung (Biomers.net^® - Ulm, Deutschland)

• T-786C Sense: lypophilisiert in 385 μl HPLC-H2O (=100 pmol)

• T-786C Antisense: lypophilisiert 181 μl HPLC-H2O (=100 pmol) Verdünnung auf 10 pmol (1:10): 10 μl 100 pmol Primer + 90 μl HPLC-H2O Die Amplifikation der DNA wurde mit einem Mastercycler (Eppendorf^® - Hamburg, Deutschland) in 30 Zyklen durchgeführt. Die Denaturierung der doppelstrangigen DNA fand bei 94°C und einer Laufzeit von 1 Minute statt. Bei 58°C wurden die Primer hybridisiert. Die Elongation der Primer durch die Taq-Polymerase fand bei 72°C und einer Laufzeit von 2 Minuten statt. Zusätzlich erfolgte eine „Vorlaufzeit“ von 5 Minuten bei 94°C sowie eine „Nachlaufzeit“ von 5 Minuten bei 72°C.

Für die Analyse des T-786C-SNPs wurde ein 657 Basenpaare langes Fragment der Promotorregion (GenBank™ Accession No. D26607; -1113 bis -456) mittels PCR amplifiziert (forward primer 5´-GAGTCTGGCCAACACAAATCC-3´, reverse primer 5´-GACCTCTAGGGTCAT-GCAGGT-3´).

2.3.3 Restriktionsverdau

Um die nun amplifizierte DNA einem Genotyp zuweisen zu können, nutzt man die unterschiedliche Länge von zerschnittenen DNA-Sequenzen homologer Chromosomen, welche als verschiedene Restriktionsfragmentmuster sichtbar werden - den Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (RFLP). Mit Hilfe einer Restriktionsendonuklease werden die DNA-Sequenzen anhand einer spezifischen Erkennungssequenz geschnitten. Die von uns verwendete Endonuklease HpaII besitzt eine selektive Bindungsstelle für die C-Typ – Promotorregion des amplifizierten eNOS-Genabschnittes. Sie schneidet also bei einem durch den Polymorphismus durchgeführten Basenaustausch von Tyrosin durch Cytosin an Stelle 786 bp. Somit entstehen verschiedene Längen des Amplifikats, je nach Genotyp des untersuchten Patienten. Sichtbar werden diese durch die anschließende Gelelektrophorese.

2.3.4 Gelelektrophorese

Die Gelelektrophorese dient der Auftrennung unterschiedlich langer DNA-Fragmente nach ihrer Größe. Das Gel dient dabei als Trägersubstanz: Die Moleküle des Gels bilden ein engmaschiges Netz, welches die zu trennenden DNA-Fragmente bei ihrer Wanderung innerhalb eines elektrischen Feldes behindert. Da DNA negativ geladen ist, wandert sie innerhalb eines elektrischen Feldes zum positiven Pol. Die einzelnen Moleküle bewegen sich aufgrund ihrer spezifischen elektrischen Ladungen und vor allem aber ihrer Größe unterschiedlich schnell innerhalb des Gels. Nach einiger Zeit sind die verschiedenen Fragmente an unterschiedlichen Stellen im Gel einzeln nachweisbar und können mit Hilfe von Ethidiumbromid gefärbt und somit sichtbar gemacht werden. So entstehen typische Abfolgen von Banden der verschieden langen DNA-Fragmente.

Die elektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte in einem 3% Agarose-Gel (MetaPhor-Agarose der Firma Biozym^® Scientific GmbH – Hessisch Oldendorf, Deutschland). Hierzu wurden 3 g des Agarose-Gels mit 100 ml eines 1fach TAE-Puffers (0,04 mM Tris-Acetat, 2 mM EDTA) gemischt. 80 ml wurden daraus entnommen und mit 8 μl Ethidiumbromid (Merck^® KGaA – Darmstadt, Deutschland) vermischt.

Elektrophoretisch aufgetrennt wurde das PCR-Produkt bei 100 Volt, bis eine hinreichende Trennung erreicht war. Die Geltasche wurde mit 1 μl Loadingbuffer (Carl Roth^® GmbH + Co. KG – Karlsruhe, Deutschland) und 6μl der DNA-Probe beladen.

Des Weiteren wurde ein Längenstandard von 100 bp (Carl Roth^® GmbH + Co. KG – Karlsruhe, Deutschland) sowie eine Negativkontrolle, welche keine DNA beinhaltete, aufgetragen. Dann erfolgte für eine halbe Stunde das Anlegen des elektrischen Felds über dem Gel. Das im Gel enthaltene Ethidiumbromid interkaliert in die DNA und fluoresziert unter UV-Licht, was eine genau Detektion der einzelnen Banden möglich macht.

Die fotographische Erfassung erfolgte in einem UV-Transilluminator (Biometra^® biomedizinische Analytik GmbH – Göttingen, Deutschland) mit Hilfe einer CCD-Kamera und einer anschließenden computergestützten Auswertung (BioDocAnalyze Biometra^® biomedizinische Analytik GmbH – Göttingen, Deutschland).

Die Patienten wurden schließlich nach ihrem Genotyp in drei Gruppen eingeteilt: TT (Wildtyp), TC (heterozygot für den Polymorphismus) und CC (homozygot für den Polymorphismus).