III. Weitere Medienzusätze
2.4 Molekulargenetische Arbeiten mit DNA
2.4.3 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) .1 Auswahl der Primer
Die Ableitung der Primer erfolgte unter Verwendung des Computerprogramms OLIGO aus bekannten Sequenzen.
Die Oligonukleotid-Primer (Tabelle 5) wurden von kommerziellen Anbietern (Gibco BRL, Eggenstein; Metabion GmbH, Martinsried) bezogen. Sie wurden in H2O gelöst und auf eine Endkonzentration von ca. 20 pmol/µl verdünnt.
Tab. 5: Übersicht über die verwendeten Primer
Ü
Übbeerreexxpprreessssiioonnss--PPrriimmeerr P
Prriimmeerr--NNaammee// OOrriieennttiieerruunngg SeSeqquueennzz 55‘‘-->>33PPoossiittiioonn a BBeesscchhrreeiibbuunngg S
Sttrreeppttaagg ZZnnTTpp SSacacIIII → → AAAAAAAACCCCGGCCGGGGTTGGAAGGTTCCTTTTCCAAAAGGTTCCCCCCCCAACCCCAATT KKlloonniieerruunngg vovon n ZZAATT11 (
(SSaaccIIII// PPssttII)) iinn ppAASSKK33 S
Srreeppttaagg ZZnnTTpp PPssttII ← ← AAAAAAAACCTTGGCCAAGGGGCCGGCCTTCCGGAATTTTTTGGTTAATTCCGGTTGGAACC KKlloonniieerruunngg vovon n ZZAATT11 ((SSaaccIIII// PPssttII)) iinn ppAASSKK33 ppAASSKK55 SSaaccIIII → → AAAAAAAACCCCGGCCGGGGTTCCGGAAGGTTCCTTTTCCAAAAGGTTCCCCCCCCAACCCCAATT KKlloonniieerruunngg vovon n ZZAATT11
((SSaaccIIII// PPssttII)) iinn ppAASSKK55 ppAASSKK55 PPssttII ← ← AAAAAAAACCTTGGCCAAGGGGTTGGCCGGCCTTCCGGAATTTTTTGGTTAATTCCGGTTGGAACC KKlloonniieerruunngg vovon n ZZAATT11
((SSaaccIIII// PPssttII)) iinn ppAASSKK55
S
Seeqquueennzziieerrpprriimmeerr S
Sttrreeppttaagg33 uupp → → AAGGTTAAGGCCGGGGTTAAAAAACCGGGGCCAAGGAACCAA bbiinnddeett ststrroommaabbwwäärrttss ddeerr M
MCCSS vvoon n ppAASSKK33 S
Sttrreeppttaagg33 ddoowwnn ← ← CCAAGGTTGGAATTAAGGAAGGAAAAAAAAGGTTGGAAAA bbiinnddeett ssttrroommaauuffwwäärrttss ddeerr MMCCSS vvoon n ppAASSKK33
UUpprr--AABBII ← CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT ← UUnniivveerrssaall PPrriimmeerr,, SSeeqquueennzziieerrpprriimmeerr ffüürr AABBII RRpprr--AABBII → → CAGGAAACAGCTATGAC RReevveerrssee PPrriimmeerr,,
SSeeqquueennzziieerrpprriimmeerr ffüürr AABBII U
Upprr--CCYY‘‘55 ← ← CCYY’’55-CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT UUnniivveerrssaall PrPriimmeerr,, CYCY‘‘55- -m
maarrkkiieerrtteerr S
Seeqquueennzziieerrpprriimmeerr (A(ALLFF)) f
füürr ppUUCC-- uunndd pGpGEEMM--TT- -EEaassyy--KKoonnssttrruukkttee
RRpprr--CCYY‘‘55 → → CCYY’’55-CAGGAAACAGCTATGAC RReevveerrssee PrPriimmeerr,, CYCY‘‘55- -mmaarrkkiieerrtteerr
SSeeqquueennzziieerrpprriimmeerr (A(ALLFF)) f
füürr ppUUCC-- uunndd pGpGEEMM--TT- -E
Eaassyy--KKoonnssttrruukkttee T
T33 ← ← AAAATTTTAAAACCCCCCTTCCAACCTTAAAAAAGGGGGG bbiinnddeett aann dedenn TT33--PPrroommoottoor r i
inn PPllaassmmiiddeenn (p(pBBlluueessccrriipptt,, ppGGEEMM TT--EEaassyy))
T
T77 → → GGTTAAAATTAACCGGAACCTTCCAACCTTAATTAAGGGGGGCC bbiinnddeett aann dedenn TT33--PPrroommoottoor r iinn PPllaassmmiiddeenn (p(pBBlluueessccrriipptt,, ppGGEEMM TT--EEaassyy))
RTRT--PPCCRR--PPrriimmeerr
GGAA 995577 → → TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT bbiinnddeett amam polyA+ -Schwanz der mRNA G
GAA 994488 ← ← GGTTCCGGGGCCGGTTAAGGCCAAGGGGGGTTTT TT TT CC GG CC GG GG
d
deeggeenneerriieerrtteerr PPrriimmeerr ddeerr T
TMMHH IIVV ddeerr CCDDFF--PPrrootteeiinnee
GGAA 994499 → → GGCCAATTCCTTCCCCCCAAAATTAACCGGTTGGAAAAAAAAAAAAGGAACCTTCCCC GG TT GGAA AA TT GGGG CC AA AA AA GG CC
ddeeggeenneerriieerrtteerr PPrriimmeerr ddeerr TTMMHH VV ddeerr CCDDFF--PPrrootteeiinnee
112233ppepep uupp → → GGCCCCTTGGTTCCAACCAATTGGCCTTGGTTTTTTGGAA bbiinnddeett anan dederr TMTMHH II ddeerr KKaarrttooffffeell CCDDFF--SSeeqqueuennzz (
(112233ppepep)) 1
12233ppepep ddoowwnn ← ← AAGGCCAAGGCCCCCCAACCCCAAAACCAAGGAACCAACC bbiinnddeett anan ddeerr TTMMHH IVIV ddeerr K
Kaarrttooffffeell CCDDFF--SSeeqqueuennzz (
(112233ppepep))//ssppeezz.. RReeiinniigguunngg 112233ppepep uupp//BBiioottiinn → → BBIIOOTTIINN -- GGCCCCTTGGTTCCAACCAATTGGCCTTGGTTTTTTGGAA bbiinnddeett anan dederr TMTMHH II ddeerr
KKaarrttooffffeell CCDDFF--SSeeqqueuennzz ((112233ppeepp))//ssppeezz.. RReeiinniigguunngg 112233ppepep ddoowwnn//BBiioottiinn ← ← BBIIOOTTIINN -- AAGGCCAAGGCCCCCCAACCCCAAAACCAAGGAACCAACC bbiinnddeett anan ddeerr TMTMHH IVIV ddeerr
KKaarrttooffffeell CCDDFF--SSeeqqueuennzz (
(112233ppeepp)) 1
12233ppepep ddoowwnn22 ← ← TTCCAATTCCAAAAAACCCCAAGGCCAAGGCCAAAAAATT bbiinnddeett aann TTMMHH I I ddeerr T
Toommaatteenn 121233ppeepp--SSeeqqueuennzz ssttrroommaauuffwwäärrttss
112233ppepep uupp22 → → GGTTGGTTCCTTGGTTTTGGGGTTGGGGGGCCTTGGCCTT bbiinnddeett anan TMTMHH IIVV ddeerr TToommaatteenn 121233ppeepp--SSeeqqueuennzz ssttrroommaabbwwäärrttss
TT33 → → AAAATTTTAAAACCCCCCTTCCAACCTTAAAAAAGGGGGG bbiinnddeett aann dedenn TT33--PPrroommoottoor r i
inn PPllaassmmiiddeenn ((ppBBlluueessccrriippt)t) T
T77 ← ← GGTTAAAATTAACCGGAACCTTCCAACCTTAATTAAGGGGGGCC bbiinnddeett aann dedenn TT33--PPrroommoottoor r i
inn PPllaassmmiiddeenn ((ppBBlluueessccrriippt)t) S
SKK → → CCGGCCTTCCTTAAGGAAAACCTTAAGGTTGGGGAATTCC bbiinnddeett inin MCMCSS vvoonn p
pBBlluueessccrriipptt
KKSS ← ← TTCCGGAAGGGGTTAAGGAACCGGGGTTAATTCC bbiinnddeett inin MCMCSS vvoonn ppBBlluueessccrriipptt
KlKloonniieerruunnggsspprriimmeerr
AArraatthh.. EEccooRRII → → AAAAAAGGAAAATTTTCCAAGGGGAAGGTTTTTTCCTTAATTGGGGAAGGTTCCTTTTCCAAAAGG TTCCCCCCCCAA
KKlloonniieerruunngg vovon n ZZAATT11 mimitt RRBBSS ((ffeetttt)) vvoonn cczzccDD AArraatthh.. BBaammHHII ← ← AAAAAAGGGGAATTCCCCTTTTAAGGCCGGCCTTCCGGAATTTTTTGGTTAATTCCGGTT KKlloonniieerruunngg vvoonn ZZAATT11 GGAA 994466 → → AACCCCAAGGGGAAAAAACCTTAAAATTAAGGAAGGTTCCAA KKlloonniieerruunngg vovonn ZZRRCCII
(
(11337700bpbp)) G
GAA 994477 ← ← CCTTTTCCAAGGCCCCCCTTTTTTAATTAATTCCTTTTTTAA KKlloonniieerruunngg vovonn ZZRRCCII (
(11337700bpbp)) G
GAA 995500 → → GGTTGGGGGGTTGGTTCCGGCCAAGGGGGGTTTTGG bbiinnddeett anan ddeerr TMTMHH IIVV vvoonn C
COOTTII
GGAA 995511 ← ← AAGGCCAATTCCGGCCCCCCAAAAAAAACCGGTTGGAAAAGGAAAAAACCAACC bbiinnddeett anan ddeerr TMTMHH VV vvoonn CCOOTTII
GGAA 667788 → → CCCCGGGGAATTCCCCGGGGAACCTTCCTTTTGGAATTGGTTAATTCCTTCCCCGGGG KKlloonniieerruunngg vovonn ZZRRCCII ((22338855bpbp))
GGAA 667799 ← ← GGGGCCTTGGCCAAGGGGGGAAAACCAAAAGGCCAAGGGGCCGGCCCCCCGG KKlloonniieerruunngg vovonn ZZRRCCII (
(22338855bpbp)) G
GAA 668800 → → AATTCCCCGGCCAATTAAAAAACCGGAAGGAAAAGGAACCTT KKlloonniieerruunngg vvoonn COCOTTII (
(11660000bpbp)) G
GAA 668811 ← ← TTTTTTCCGGCCTTTTTTTTCCCCTTCCTTTTTTTTTTTTTT KKlloonniieerruunngg vvoonn COCOTTII (
(11660000bpbp)) cczzccRR oouu ← ← AAAAAACCAAAATTTTGGGGCCGGGGTTTTCCGGTTCCTTTTCCTTAACCAAAACCAAAAGGTTAACC
CC
KKlloonniieerruunngg vvoonn czczccDD ((11330000bpbp))
cczzccDD ood d → → AAAAAACCAATTAATTGGGGCCGGAACCTTGGCCGGTTCCCCGGGGTTGGCCTT KKlloonniieerruunngg vvoonn czczccDD ((11330000bpbp))
ZZaatt// RRBBSS EEccooRRII → → AAAAAAGGAAAATTTTCCGGCCCCCCCCTTTTAACCCCCCAAGGAAGGAATTAAGGAATT KKlloonniieerruunngg vovon n ZZAATT11 mimitt e
eiiggeenneerr RRBBSS
∆
∆ZZaatt uupp ← ← AAAAAAGGGGTTAACCCCCCCCCCTTAAGGCCAAGGAAAACCAAGGCCCCAATTTTAATTGGAATT bbiinnddeett anan ddeenn BaBasseenn 669977- -7
71177 ddeess ZAZATT11--GGeennss,, KKoonnssttrruukkttiioon n vvoonn ∆Z∆ZAATT11
∆
∆ZZaatt ddoowwnn → → AAAAAAGGGGTTAACCCCGGGGGGGGAATTGGTTTTAACCTTGGAAGGCCAAAATTTTGGTTTTGG bbiinnddeett anan ddeenn BaBasseenn 554433- -551199 ddeess ZAZATT11--GGeennss,, KKoonnssttrruukkttiioon n vvoonn ∆Z∆ZAATT11 ZZaatt--SSttrreeppttaagg NNoottII → → AAAAAAGGCCGGGGCCCCGGCCTTAAGGAAGGAAAAAAAAGGTTGGAAAAAATTGGAAAATTAA KKlloonniieerruunngg dederr StStrreeppttaagg
FFuussiioonnsspprrootteeiinnee iinn ppYYEESS22 ZZaatt--SSttrreeppttaagg SSpphhII ← ← AAAAAAGGCCAATTGGCCTTCCAACCTTTTCCAACCAAGGGGTTCCAAAAGGCCTTTTAA KKlloonniieerruunngg dederr StStrreeppttaagg
FFuussiioonnsspprrootteeiinnee iinn ppYYEESS22
K
Knnoocckk oouutt--PPrriimmeerr
∆∆ZZrrccII PP11 → → AAAAAAAACCCCGGCCGGGGTTCCCCCCTTAACCCCTTAACCGGCCCCGGAAAAAAAATTAATTAATT A
A
b
biinnddeett ccaa.. 440000bb s
sttrroommaabbwwäärrttss dedess ZZRRCCII- -GGeennss,, KKoonnssttrruukkttiioon n vvoonn
∆
∆ZZRRCCII
∆
∆ZZrrccII PP22 ← ← AAAAAAAAGGGGAATTTTCCGGAATTTTCCTTCCAAAATTTTCCTTTTTTAACCCCGGGGTTGGAATT bbiinnddeett ccaa.. 4040bb ssttrroommaauuffwwäärrttss ddeess ZZRRCCII- -SSttaarrttccooddoonnss,, KoKonnssttrruukkttiioonn vvoonn ∆∆ZRZRCCII
∆∆ZZrrccII PP33 → → AAAAAAAAGGAAAATTTTCCAAAACCTTGGCCAAAATTAACCTTTTCCCCAAAATTTTGGCCCCTTGG bbiinnddeett ccaa.. 4040bb ssttrroommaabbwwäärrttss dedess ZZRRCCII- -S
Sttooppccooddoonnss,, KoKonnssttrruukkttiioonn v
voonn ∆∆ZRZRCCII
∆∆ZZrrccII PP44 ← ← AAAAAAAACCTTGGCCAAGGGGCCAACCTTTTAAGGTTAAAAAATTTTGGGGAAGGCCAAGGGGGG T
TTT
b
biinnddeett ccaa.. 440000bb s
sttrroommaauuffwwäärrttss ddeess ZZRRCCII- -GGeennss,, KKoonnssttrruukkttiioon n vvoonn
∆
∆ZZRRCCII
∆
∆CCoottII PP11 → → AAAAAAAACCCCGGCCGGGGGGAAGGGGGGAAAAAAAAAAGGAAAAAAGGTTGGTTGGGGAAGG GGAAGG
bbiinnddeett ccaa.. 447700bb ssttrroommaabbwwäärrttss ddeess COCOTTII- -GGeennss,, KKoonsnsttrruukkttiioon n vvoonn
∆∆CCOOTTII
∆∆CCoottII PP22 ← ← AAAAAAAAGGGGAATTTTCCTTTTTTTTAACCCCTTGGTTTTTTGGCCTTTTCCCCGGAAGGTTTTTT bbiinnddeett ccaa.. 4040bb s
sttrroommaauuffwwäärrttss ddeess COCOTTII- -S
Sttaarrttccooddoonnss,, KoKonnssttrruukkttiioonn vvoonn ∆∆COCOTTII
∆
∆CCoottII PP33 → → AAAAAAAAGGAAAATTTTCCAACCAAGGCCTTGGAATTTTGGCCTTTTAAGGAAGGGGAATTCCAA TT
b
biinnddeett ccaa.. 4040bb ssttrroommaabbwwäärrttss ddeses COCOTTII- -SSttooppccooddoonnss,, KoKonnssttrruukkttiioonn vvoonn ∆∆COCOTTII
∆∆CCoottII PP44 ← ← AAAAAAAACCTTGGCCAAGGAAAAGGCCTTGGGGAAGGTTAAAATTCCTTAAAAAAAAAAAAAAGG CC
bbiinnddeett ccaa.. 330000bb ssttrroommaauuffwwäärrttss ddeess COCOTTII- -G
Geennss,, KKoonnssttrruukkttiioon n vvoonn
∆∆CCOOTTII G
Geenne-e-ddiissrruupptitioonn--PPrriimmeerr F
F 1122 → → AATTGGAAAAAACCTTCCGGGGAAAAGGCCAAAAAACCAAGGGGTTAAAAAAAAAATTTTAATTAA TTCCCCTTTTGGTTCCAAGGCCTTGGAAAAGGCCTTTTCCGGTTAACCGGCC
e
enntthhäälltt amam 55´´EEnnddee ddiiee eerrsstteenn 4040bb dedess CCOOTTII--GGeennss,, ggeekkooppppeelltt mmiitt 5´5´EEnnddee dedess KKaannaammyycciinn-- rreessiisstteennzz--GGeennss,, KKoonnssttrruukkttiioonn eeiinneerr COCOTTII-- K
Kmm-- KKaasseettttee G
G 0011 ← ← AAAATTGGAATTCCCCTTCCTTAAAAGGCCAAAATTGGAAGGCCTTGGTTGGTTTTGGCCAAGGTTTT G
GGGCCAAGGCCAATTAAGGGGCCCCAACCTTAAGGTTGGGGAATTCCTTGG
e
enntthhäälltt amam 55´´EEnndde e ddiiee l
leettzztteenn 4400bb ddeess CCOOTTII--GGeennss,, g
geekkooppppeelltt mmiitt 3´3´EEnnddee dedess KKaannaammyycciinn-- rreessiisstteennzz--GGeennss,, KKoonnssttrruukkttiioonn eeiinneerr COCOTTII-- KKmm-- KKaasseettttee