2.5.1 Methode der polychromen Sequenzmarkierung
Durch die polychrome Sequenzmarkierung lassen sich dynamische Umbauvorgänge während des Knochenumbaus darstellen (Rahn 1976). Dazu wurde den Ratten während der Knochenheilung zu bestimmten Zeiten eine definierte Menge an Fluorochromen als Markersubstanz appliziert (Tabelle 6). Diese wurden in das neugebildete Knochengewebe
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als Calcium-Chelat-Komplex eingelagert. Durch die Applikation an zuvor definierten Tagen lässt sich eine genaue Zuordnung des neugebildeten Kallus zum Bildungszeitpunkt und -ort herstellen und so die Kallusbildung nachvollziehen (Stuermer et al. 2010b). Die eingelagerten Farbstoffe lassen sich nach Präparation und Anfertigung von Schnittprä-paraten analog zu 2.4.1 und Fixation auf Objektträgern durch eine fluoreszenzs-mikroskopische Untersuchung nachweisen und analysieren.
2.5.2 Fluorochrome
Als Markersubstanz fanden die Fluorochrome Xylenol-Orange (XO), Calcein-Grün (CG), Alizarin-Komplexon (AK) und Tetracyclin (TC) Anwendung (Tabelle 6). Dazu wurden diese Farbstoffe in Kochsalzlösung (für TC) oder in destilliertem Wasser (für XO, CG und AK) gelöst und intravital subkutan den Ratten appliziert. Daraufhin wurden die Fluorochrome durch Komplexbildung in das neuentstandene Knochengewebe eingelagert.
Tabelle 6: Einteilung der Fluorochrome nach verwendetem Farbstoff, Dosierung, Applikationstag, Markierungszeitraum und Fluoreszenz
Fluorochrom Dosierung [mg/kg KG]
Applikationstag [nach Osteotomie]
Markierungszeitraum [nach Osteotomie]
Fluoreszenz
XO 90 13 0-13 orange
CG 10 18 14-18 grün
AK 30 24, 26 19-26 rot
TC 25 35 27-35 gelb
2.5.3 Auswertung der polychromen Sequenzanalyse
Die bereits in Punkt 2.4.1 beschriebenen angefertigten Schnitte wurden für die polychrome Sequenzanalyse mittels Eukitt (Firma Kindler, Freiburg, Deutschland) auf Objektträgern fixiert. Die Auswertung erfolgte mit einem Auflicht-Fluoreszenz-Stereomakroskop (Leica Stereomakroskop MZ 7-5 mit FluoCombi III, Bensheim, Deutschland) in Blaufluoreszenz.
Eine Quecksilberhöchstdrucklampe (50 W) wurde als Lichtquelle verwendet und die erforderliche Fluorochromanregung mit Blaulicht durch einen Anregungsfilter für den Wellenbereich 450 bis 490 nm erreicht. Wie auch in Punkt 2.4.2 erfolgte das Einlesen der Schnitte über eine Kamera (Leica DC 300F) und die Auswertung über die Software „Leica Quantiment QWin 2003“ (Leica; Bensheim; Deutschland). Analog zur Mikroradiographie hat sich für die polychrome Sequenzanalyse die Verwendung eines 1,6er Objektivs am
Makroskop für eine vollständige Abbildung entsprechend des Kallus etabliert. Die Belichtungszeit für eine ausreichende Helligkeit bei Abbildung der Schnitte betrug für jedes Bild in Abhängigkeit von der Schnittdicke 9,7 bis 12,9 s.
Die histologische Auswertung erfolgte randomisiert. In der Tabelle 7 sind die einzelnen Parameter der polychromen Sequenzmarkierung, welche anhand der Software bestimmt wurden, mit ihrer Berechnungsgrundlage im Einzelnen dargestellt. Folgende Arbeitsschritte wurden in gleicher Reihenfolge nacheinander an je drei Schnitten pro Tibia durchgeführt:
Digitalisieren der Präparate
Mit der unter 2.5.3 beschriebenen Hard- und Software erfolgte die Digitalisierung. Um eine vergleichende Auswertung zu gewährleisten, wurde stets die identische Position für die Schnitte gewählt, sodass sich der kraniale Teil der Tibia am oberen, der kaudale am unteren, der plattennahe am linken und der plattenferne am rechten Bildrand des Monitors darstellte.
Flächendefinition
Analog zu Punkt 2.4.2 erfolgte das Umfahren der zu bestimmenden Strukturen auf dem Grafiktablett. Dabei wurde die Flächenbegrenzung zur Kontrolle als Linie (Linienstärke 2,1 Pixel ≙ 6,73 µm) abgebildet und konnte im Anschluss korrigiert werden. Ebenfalls war es möglich, verschiedene markierte Areale als eine Fläche zusammenzufassen, wobei jedoch eine Mehrfachzuordnung durch das Programm verhindert wurde.
Flächen-Fluorochrom-Zuordnung
Im Anschluss an die Flächendefinition wurden die Gebiete, welche fluoreszierten, von der Gesamtfläche abgegrenzt und je nach Fluoreszensverhalten der jeweiligen Substanz zugeordnet (Abbildung 11). Die Reihenfolge der Flächen-Fluorochrom-Zuordnung (XO,
CG, AK, TC) war durch das Programm vorgegeben. Anwendung fanden dabei nur die plattennahen, plattenfernen und endostalen Kallusflächen. In die Auswertung gingen dabei nur die CG, AK und TC gefärbten Flächen ein. Die XO gefärbten Flächen wurde von CG überlagert, sodass dem standardisierten Messprogramm eine getrennte Identifizierung dieser Flächen nicht möglich war.
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Abbildung 11: Polychrome Sequenzanalyse des Osteotomiekallus der Rattentibia (Tibia 10, Gruppe 1, Schnitt 5, grün-fluoreszierend ≙ CG markierte Fläche, rot-fluoreszierend ≙ AK markierte Fläche, gelb-fluoreszierend ≙ TC markierte Fläche)
Die Gesamtfläche des Kallus, der CG-Fläche, der AK-Fläche und der TC-Fläche des Kallus wurde durch das Programm als absolute Fläche von plattennahem, plattenfernem bzw. endostalem Kallus in Quadratmillimetern bestimmt. Der Additivkallus setzt sich als absolute Kallusfläche, errechnet aus der Summe von plattennaher, plattenferner und endostaler Kallusfläche zusammen und wird ebenfalls in Quadratmillimetern angeben.
Tabelle 7: Messparameter der polychromen Sequenzmarkierung und deren Berechnungsgrundlage
Messparameter [Einheit] Berechnungsgrundlage
Gesamtfläche Kallus plattennah [mm²] absolute Fläche des gesamten plattennahen Kallus
CG-Fläche Kallus plattennah [mm²] absolute Fläche des CG-markierten plattennahen Kallus
AK-Fläche Kallus plattennah [mm²] absolute Fläche des AK-markierten plattennahen Kallus
TC-Fläche Kallus plattennah [mm²] absolute Fläche des TC-markierten plattennahen Kallus
Gesamtfläche Kallus plattenfern [mm²] absolute Fläche des gesamten plattenfernen Kallus
CG-Fläche Kallus plattenfern [mm²] absolute Fläche des CG-markierten plattenfernen Kallus
AK-Fläche Kallus plattenfern [mm²] absolute Fläche des AK-markierten plattenfernen Kallus
TC-Fläche Kallus plattenfern [mm²] absolute Fläche des TC-markierten plattenfernen Kallus
Gesamtfläche Kallus endostal [mm²] absolute Fläche des gesamten endostalen Kallus
CG-Fläche Kallus endostal [mm²] absolute Fläche des CG-markierten endostalen Kallus
AK-Fläche Kallus endostal [mm²] absolute Fläche des AK-markierten endostalen Kallus
TC-Fläche Kallus endostal [mm²] absolute Fläche des TC-markierten endostalen Kallus
Additivkallus [mm²] Summe der gesamten plattennahen, plattenfernen und endostalen Kallusflächen