Pharmakophor-Modelle

Abb. 74: Überlagerung aller Derivate des Datensatzes.

Die für die spätere Berechnung der CoMFA- und CoMSIA-Felder nötigen Ladungen wurden mit Hilfe des Programms MOPAC mit der semiempirischen AM1-Methode berechnet. Als Parameter für die Berechnung wurden folgende Schlüsselwörter (Keywords) verwendet:

1. MMOK (Zusätzliche Parametrisierung für die Geometrie von Amidbindungen) 2. XYZ (Durchführung der Berechnung in Kartesischen Koordinaten).

Weitere bei der Berechnung verwendete Parameter waren: keine Geometrie-optimierung, Singulett-Zustand, normale Konvergenz.

Abb. 75:

PLS-Gleichung der Wechsel-wirkungsenergien zwischen Sonde und Molekül (S₁,E₁,S₂,E₂,…) an definierten Gitterpunkten am Beispiel von WK-X-51.

und elektrostatischen Wechselwirkungsenergien zwischen diesen und dem Ligand zu berechnen (Abb. 75). Als Abstand zwischen den Gitterpunkten hat sich ein Wert von 2 Å bewährt [Globisch, 2002]. Die erhaltenen Wechselwirkungsenergien werden für jedes Molekül berechnet und mit seiner biologischen Aktivität (pKi) mittels der PLS-Analyse korreliert.

Zur Ermittlung der sterischen und elektrostatischen Wechselwirkungsenergien wird meistens ein sp³-hybridisiertes Kohlenstoffatom mit einer Ladung von +1 verwendet.

Als Berechnungsgrundlage der van-der-Waals-Energien dient das Lennard-Jones-Potential, das wie folgt definiert ist:

Als Berechnungsgrundlage der elektrostatischen Wechselwirkungsenergien verwendet man das Coulomb-Potential. Als Sonde dient eine Ladung von +1:

Abb. 76:

Lennard-Jones-Potential und Coulomb-Potential [Böhm et al., 2002].

Sieht man sich die Potentialverläufe des Lennard-Jones-Potentials und des Coulomb-Potentials (Abb. 76) an, erkennt man, dass bei sehr kleinen Abständen zwischen Molekül und Sonde beide Potentiale sehr große Werte annehmen. Um extrem große Feldbeträge zu

vermeiden, werden definierte Grenzwerte (Cut-offs) zur Begrenzung der Potentiale verwendet.

Der steile Verlauf der Potentiale nahe den Atomen bedingt, dass sich die Werte bei kleinen Abstandsänderungen schnell von niedrigem Potential zum Grenzwert ändern. Beim Lennard-Jones-Potential ist dies schon bei Gitterpunktabständen von 2 Å zu beob-achten.

5.2.2. Die CoMSIA-Methode

Mit der CoMSIA-Methode (engl. Comparative Molecular Similarity Indices Analysis), steht ein weiteres Verfahren zur Verfügung, um überlagerte Verbindungen miteinander zu vergleichen. Entwickelt wurde diese Methode von Klebe et al. bei der Firma BASF [Klebe et al., 1999]. Die Durchführung einer CoMSIA zeigt Analogien zur CoMFA, jedoch werden im Gegensatz dazu hier nicht die Unterschiede der Moleküle verglichen, sondern ihre relativen Ähnlichkeiten. Als mögliche Feldtypen stehen sterische, elektrostatische, hydrophobe, sowie Wasserstoffbrücken-Donor und Akzeptor Eigenschaften zur Verfügung. Diese Ähnlichkeiten werden abstandsabhängig mittels einer Gauß-Funktion zwischen dem Sonden-Atom und dem Molekül berechnet:

Abb. 77:

Vergleich der Gaußschen Abstandsfunktion der CoMSIA-Methode mit den Lennard-Jones- und Coulomb-Potentialen [Böhm et al., 2002].

(A Ähnlichkeitsmaß für Feldtyp F am Gitterpunkt q aufsummiert für alle Atome i des Moleküls

j; w_probe,k Eigenschaftswerte der Sonde: Radius 1 Å, Ladung +1, Hydrophobie +1,

WBB-Donor +1, WBB-Akzeptor +1; w_ik Eigenschaftswert des Atoms i; r_iq Abstand zwischen Sonde und Atom; α Dämpfungsfaktor der Wechselwirkung mit dem Abstand).

Im Gegensatz zum Verlauf des Lennard-Jones- und des Coulomb-Potentials strebt die Gaußkurve auch für kleinere Abstände zwischen Molekül und Sonde gegen einen endlichen Wert. Es müssen also keine Grenzwerte festgesetzt werden [Böhm et al., 2002]. So können auch Interaktionen innerhalb der Moleküle sowie an oberflächennah gelegenen

Gitter-punkten berechnet werden. Die erhaltenen Wechselwirkungsenergien werden analog zur CoMFA für jedes Molekül berechnet und mit seiner biologischen Aktivität (pKi) mittels der PLS-Analyse korreliert.

5.2.3. Die PLS-Analyse

Die PLS-Analyse ist eine multivariate statistische Methode, bei der durch schrittweise Extraktion von Informationen aus einer Datenmatrix ein lineares Modell zwischen abhängigen Aktivitätsvariablen und unabhängigen Strukturvariablen berechnet wird.

Bei einer PLS-Analyse von Daten einer CoMFA oder CoMSIA werden aus den Aktivitätsdaten (Y-Matrix; abhängige Variablen) und den berechneten Feldvariablen (X-Matrix, unabhängige Variablen) so genannte „latente Variablen“ (Komponenten) extrahiert, die ein Maximum der Varianz der X-Matrix enthalten und gleichzeitig optimal mit der Y-Matrix korrelieren. Die Extraktion der Komponenten geschieht schrittweise, wobei jede weitere Komponente die verbliebene Restvarianz beschreibt und somit zur vorherigen unkorreliert (orthogonal) ist. Je größer die Anzahl der

Komponenten und damit die erklärte Gesamtvarianz, desto perfekter ist die Korrelation.

Eine PLS-Analyse eignet sich besonders dann, wenn die Anzahl der Strukturparameter größer ist als die Anzahl der ausgewählten Verbindungen, bzw.

Interkorrelationen zwischen den Parametern existieren.

5.2.4. Validierung der PLS-Ergebnisse

Zur Kontrolle der Qualität des Modells werden verschiedene Validierungsverfahren angewandt. Bei der Kreuzvalidierung (engl. cross-validation) werden aus dem Datensatz entweder eine (engl. one-out, LOO) oder mehrere (engl. Leave-many-out (Random Groups)) Verbindungen temporär entfernt und basierend auf den verbleibenden Derivaten ein Modell erstellt. Anhand dieses Modells werden die Aktivitäten der herausgenommenen Verbindungen vorhergesagt und diese mit den experimentellen Werten verglichen. Die Abweichung der vorhergesagten von den experimentellen Werten ist dabei ein Maß für die Güte des Modells.

Wichtige statistische Kenngrößen sind dabei:

Die Summe der Abweichungsquadrate PRESS (engl. PREdictive error Sum of Squares):

(Yi,exp sind die experimentellen und Yi,pred die vorhergesagten Aktivitäten) Der quadrierte Korrelationskoeffizient der Vorhersage q²:

_

(Y ist der Mittelwert der experimentellen Aktivitäten)

Der q²-Wert variiert zwischen -∞ und +1, wobei +1 einem perfekten Modell entspräche, das ohne jegliche Abweichung die Aktivitäten der ausgeschlossenen Liganden vorhersagen könnte. Negative q²-Werte bedeuten, dass die Vorhersage des Modells schlechter ist als der einfache Mittelwert aller Aktivitätsdaten (letzteres

entspräche q² = 0). Bei der Kreuzvalidierung werden der q²-Wert und die kreuzvalidierte Standardabweichung SPRESS für verschiedene Komponentenzahlen angegeben. Mit steigender Anzahl an Komponenten steigen die q²-Werte und zwar solange, wie die zusätzlichen Komponenten signifikante Informationen enthalten.

Werden zu viele Komponenten benutzt, so steigt die Wahrscheinlichkeit, dass irrelevante oder zufällig korrelierte Komponenten einbezogen werden, was zu einem Sinken des q²-Wertes und zu einem Anstieg der kreuzvalidierten Standardabweichung führt. Generell akzeptable Vorhersagen eines Modells sollten ab einem q²-Wert von etwa 0,4 - 0,5 möglich sein [Böhm et al., 2002].

Während die Leave-one-out-Kreuzvalidierung reproduzierbar gleiche Ergebnisse liefert, ist dies bei der Leave-many-out-Kreuzvalidierung (Random Groups) nicht der Fall. Bei der Leave-many-out-Kreuzvalidierung erfolgt eine zufällige Aufteilung der Verbindungen des Datensatzes in zwei bis fünf Gruppen. Eine dieser Gruppen wird bei der Erstellung des Modells nicht berücksichtigt, und anhand dieses Modells wird versucht, die Aktivität der weggelassenen Verbindungen vorauszusagen. Dieser Schritt wird für alle Gruppen wiederholt. Wegen der zufälligen Einteilung der Gruppen unterscheiden sich die q²-Werte verschiedener Durchläufe. Dieser Nachteil lässt sich jedoch durch eine hohe Wiederholungsrate der Leave-many-out-Kreuzvalidierung verringern. Der Vorteil dieser Kreuzvalidierung ist, dass sie bessere Aussagen über die Robustheit des erzeugten Modells erlaubt.

Die Ergebnisse der durch eine CoMFA oder CoMSIA gelieferten Regressionsgleichung lassen sich graphisch darstellen. Aus dem Modell weiß man, an welchen Gitterpunkten Feldbeiträge auftreten, die signifikant zur Erklärung der Bindungsaffinitäten beitragen. Diese Beiträge lassen sich nach ihrer Wichtigkeit für die verschiedenen Felder konturieren. Diese Konturdiagramme heben Regionen der Liganden hervor, in denen die Eigenschaften stark variieren und die Wechselwirkungen zur Erhöhung bzw. Erniedrigung der Affinität führen. Wegen des Cut-offs sind es bei der CoMFA nur Bereiche, die außerhalb des Moleküls liegen. Mit der CoMSIA erhaltene Konturdiagramme lassen sich oftmals einfacher interpretieren.

In diesen Diagrammen werden innerhalb des Moleküls Bereiche hervorgehoben, in denen eine Eigenschaft mit positivem oder negativem Beitrag mit der Affinität korreliert. Für das Design neuer Wirkstoffe sind diese Konturdiagramme ein wichtiges Hilfsmittel, um zu erkennen, an welchen Stellen die Eigenschaften einer Leitstruktur zu verändern sind, damit eine Affinitätssteigerung erzielt werden kann.

5.3. CoMFA- und CoMSIA-Modelle der P-gp-Modulatoren