2 Ziel der Arbeit
3.2 Phagen, Phagemide und Plasmide
Die in dieser Arbeit verwendeten Phagen, Phagemide und Plasmide sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.
Tabelle 3-2: Zusammenfassung der in dieser Arbeit verwendeten Phagen, Phagemide und Plasmide.
Angegeben ist der in dieser Arbeit verwendete Name, die selektierbare Antibiotikaresistenz, der Verwendungszweck und die Quelle für jeden Vektor.
Vektor Resistenz Eigenschaft Referenz/Quelle
VCSM Kan Helferphage Stratagene, Heidelberg
pAK200 Cm, Tet Typ 3+3, gp3ss Krebber et al. (1997) pAK-tat-wt(E/E) Cm trägt HIV-Tat-Variante
und 2 EcoO109I-Schnittstellen
S. Hoffmann, Univ. Bayreuth, LS Biopolymere
Tabelle 3-2: Zusammenfassung der in dieser Arbeit verwendeten Phagen, Phagemide und Plasmide.
Angegeben ist der in dieser Arbeit verwendete Name, die selektierbare Antibiotikaresistenz, der Verwendungszweck und die Quelle für jeden Vektor.
Vektor Resistenz Eigenschaft Referenz/Quelle
pAK-tat-mtRRRR Cm trägt HIV-Tat-Variante S. Hoffmann, Univ. Bayreuth, LS Biopolymere
pAK-tat-mtRKKR Cm trägt HIV-Tat-Variante diese Arbeit pAK-tat-mt8bas Cm trägt HIV-Tat-Variante diese Arbeit
pGEX-4T-2 Ap prokaryotischer
Expressionsvektor
Amersham Biosciences, Freiburg, Deutschland
pcDNA3 Ap, Neo eukaryotischer
Expressionsvektor
Invitrogen, Leek, Niederlande pcDNA3.1-CT-GFP Ap, Neo eukaryotischer
Expressionsvektor
Cm, Ap trägt Ap- Kassette S. Hoffmann, Univ. Bayreuth, LS Biopolymere
pHis-hCycT1(272∆) Ap trägt Cyclin T 272∆ S. Hoffmann, Univ. Bayreuth, LS Βiopolymere
pGEX-tat-mt8bas(SfiI/SfiI)
Ap trägt HIV-Tat-Variante diese Arbeit pcDNA-tat-
mt8bas(SfiI/SfiI)
Ap, Neo trägt HIV-Tat-Variante diese Arbeit pcDNA-tat-
mt8bas(SfiI/SfiI)- GFP
Ap, Neo trägt HIV-Tat-Variante diese Arbeit
Ph.D.-12 - trägt Bibliothek aus
12 Aminosäuren
New England Biolabs, Frankfurt
3.2.1 Das pAK-System
Das verwendete pAK-System (Krebber et al., 1996a) stellt einen Phagendisplay-Vektor des Typs 3+3 (Kap. 1.4.2) dar, d. h. es liegen zwei Kopien des gp3-Gens auf zwei getrennten Genomen vor. Auf dem Helferphagen liegt das wt-Gp3 vor, das rekombinante Gp3 wird von einem Phagemid, dem pAK-Vektor, kodiert. Ein Phagemid ist ein spezielles Plasmid, das einen Replikationsursprung für die Plasmidreplikation und einen für die Replikation des Phagengenoms besitzt. Bei der Vermehrung werden in diesem System Phagenpartikel produziert, die nur eine oder höchstens zwei Kopien des Fusions-Gp3-Protein tragen und so die volle Infektosität behalten.
In pAK-Vektoren ist durch das Einfügen eines starken Transkriptionsterminators vor die Promotorregion des gp3-Fusionsgens die Hintergrundexpression vor der eigentlichen Induktion stark minimiert. Antikörper-Varianten, welche schon in geringen Mengen toxisch auf Bakterienzellen wirken, ließen sich erfolgreich als Gp3-Fusion mit pAK-Vektoren selektionieren (Krebber et al., 1996a). Das gp3-Gen liegt in stark verkürzter Form vor und beginnt erst bei Aminosäure 250 im Vorläuferprotein (gp3ss, gp3 „super short“). Somit sind die im vollständigen Gp3 enthaltenen repetitiven Glycinlinker sowie sechs der insgesamt acht Cysteinreste in Gp3ss nicht mehr vorhanden. In
Abbildung 3-1 sind die wichtigsten genetischen Marker eines pAK-Vektors aufgeführt.
Abbildung 3-1: Phagendisplay-Vektor der pAK-Serie. Die Expressionskassette des Vektors bestehend aus LacI, einem starken Terminator (tHP), der lac Promotor-/Operatorregion, einer modifizierten pelB-Signalsequenz mit SfiI-Erkennungsstelle, dem Gen für Tetracyclin-Resistenz sowie einem verkürzten Gen für das Gp3-Protein (gp3ss) und einem weiteren Terminator wurde vergrößert dargestellt. Dabei erleichtert die tet-Resistenz-Kassette die Überwachung der Restriktion des Phagemids mit SfiI. Die Klonierung über die beiden SfiI-Erkennungsstellen verläuft unidirektional, da unterschiedliche Überhänge generiert werden. Dargestellt sind pAK-tat-wt und pAK200.
3.2.2 Ph.D 12 Phagenbibliothek
Bei der Ph.D 12 Phagenbibliothek handelt es sich um ein kommerziell erhältliches System (New England Biolabs, Frankfurt) eines Typ-3 Vektors (Kap. 1.4.2). An das gp3-Gen ist N-terminal direkt nach der Signalsequenz ist eine Bibliothek aus 12 randomisierten Aminosäuren insertiert . Die Bibliothek besteht aus 1,9 x 109 unabhängigen Klonen und ist so amplifiziert und konzentriert, dass in einem Volumen von 10 µl durchschnittlich 55 Kopien einer jeden Sequenz enthalten sind. Die genaue Zusammensetzung der Bibliothek kann dem entsprechenden Handbuch entnommen werden (Biolabs, ).
Abbildung 3-2: Genom des M13-Phagen mit insertierter Bibliothek. Eine (NNK)12-Bibliothek (N: beliebige Base, K: G oder T) ist über die Schnittstellen KpnI und EagI direkt hinter die Signalsequenz von gp3 am N-Terminus kloniert
3.3 Oligonukleotide
In den folgenden Tabellen sind die in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide aufgelistet.
Alle Oligonukleotide wurden entweder von BioTeZ (Berlin) oder Sigma ARK(Deisenhofen) bezogen.
Tabelle 3-3: Zusammenfassung der Oligonukleotide, die für die Klonierung von pAK-Varianten eingesetzt wurden. Aufgelistet ist jeweils der Name, die Sequenz und die Länge.
Name Sequenz Länge
PAKlib-RKKR5(+)
5’- Phosphat-ggc ctc gga att tct tac ggt nnk nnk nnk nnk cgt cag cgt cgt cgt ccg tct cag ggt ggt caa act cat cag- 3’
75mer
PAKlib-RKKR3(+)
5’- Phosphat-gtc ctg atg agt ttg acc acc ctg aga cgg acg acg acg ctg acg iii iii iii iii acc gta aga aat tcc gag- 3’
75mer
pAKlib-RRRR5(+)
5’-Phosphat-ggc ctc gga att tct tac ggt cgt cgt aag aaa cgt nnk cag nnk nnk nnk ccg tct cag ggt ggt caa act cat cag- 3’
75mer
pAKlib-RRRR3(-)
5’-Phosphat-gtc ctg atg agt ttg acc acc ctg aga cgg iii iii iii ctg iii ttt ctt acg acc gta aga aat tcc gag- 3’
75mer
Tabelle 3-3ff: Zusammenfassung der Oligonukleotide, die für die Klonierung von pAK-Varianten eingesetzt wurden. Aufgelistet ist jeweils der Name, die Sequenz und die Länge. N: beliebige Base, K: G oder T, I: Inosin
5’-Phosphat-ggc ctc gga att tct tac ggt gcg gcg gcg gcg cgt cag cgt cgt cgt ccg tct cag ggt ggt caa act cat cag- 3’
75mer
pAKmtRKKR-3(-)
5’- Phosphat-gtc ctg atg agt ttg acc acc ctg aga cgg acg acg acg ctg acg cgc cgc cgc cgc acc gta aga aat tcc gag- 3’
Tabelle 3-4: Zusammenfassung der Oligonukleotide, die für die Umklonierung von pAK-Varianten eingesetzt wurden. Aufgelistet ist jeweils der Name, die Sequenz und die Länge.
Name Sequenz Länge
Tabelle 3-5: Zusammenfassung der Oligonukleotide, die für die Sequenzierung eingesetzt wurden.
Aufgelistet ist jeweils der Name, die Sequenz und die Länge.
Name Sequenz Länge
GFP-Rev(-) 5’- ggg taa gct ttc cgt atg tag c-3’ 22mer T7-Prom(+) 5’- taa tac gac tca cta tag gg-3’ 20mer
SP6(+) 5’- gat tta ggt gac act ata g-3’ 19mer
pGEX(+) 5’-ggg ctg gca agc cac gtt tgg tg-3’ 23mer M13-Seq(-) 5’-cta ccg taa cac tga gtt tcg-3’ 21mer