Phagen-Display

Volumen an 2x SDS-Probenpuffer resuspendiert und bei 95°C für 5 min aufgekocht. Die Analyse erfolgte anschliessend durch SDS-PAGE und Western Blot (6.3.4 und 6.3.5).

6.3.8 p24-ELISA

Der p24-ELISA dient zur Quantifizierung des HIV-Capsid-Proteins p24 in Zellkulturüberständen. Hierzu wurden zunächst die Zellkulturüberstände zur Abtrennung von Zelltrümmern zentrifugiert (5 min, 300 g, RT), der Überstand zur Inaktivierung und Lyse der HI-viralen Partikel mit 1/10 Volumen Triton X-100 für 30 min inkubiert und bis zur Verwendung bei -20°C gelagert.

Zu Beginn wurden 96-well MaxiSorp-Mikrotiterplatten (Nunc, Wiesbaden) bei 4°C üN mit 100 µl einer 1:4000-Verdünnung des CA (p24)-spezifischen monoklonalen M01-Antikörpers in Coating-Puffer inkubiert. Für die Erstellung der Standardgeraden wurde ein p24-Standard seriell 1:2 verdünnt (5000–19.5 pg/ml). Die Zellkulturüberstände wurden in folgenden Verdünnungen 1:10, 1:100 bzw. 1:1000 eingesetzt. Die unterschiedlichen Verdünnungen wurden in dem Medium erstellt, das auch für die Kultivierung von 293T-Zellen Verwendung fand. Je 100 µl aller Verdünnungen wurden nach dreimaligem Waschen der Mikrotiterplatten mit PBS/T aufgetragen und anschliessend 1 h bei 37°C inkubiert.

Anschliessend wurden die Mikrotiterplatten 6x gewaschen und je 100 µl einer Verdünnung des biotinylierten 37G12-Antikörpers (1:10000 in PBS/1 % BSA) aufgetragen und eine weitere Stunde bei RT inkubiert. Nach weiteren zehn Waschschritten wurde eine 1:10000 Mischung des Streptavidin-HRP-Konjugats (1:10000 in PBS/1 % BSA) zugegeben und für 30 min bei RT inkubiert. Nach 10x Waschen mit TTBS wurden die Antikörperkonjugate mit 100 µl einer 1:1-Verdünnung TMB-Substratlösung detektiert. Die Farbreaktion wurde mit 50 µl 1 N H²SO⁴ abgestoppt und die Adsorption mit einem Spektrophotometer (Biorad, Modell 680 Microplate Reader, München) bei 450 nm gemessen. Mit Hilfe der Standardgeraden konnte anschliessend die p24-Konzentration bestimmt werden.

mit dem Auxotrophie-Marker proAB, der zur Synthese der Aminosäure Prolin nötig ist, selektioniert werden. Desweiteren kann dieser Suppressorstamm das Amber-Stopp-Codon (TAG) überlesen, da er eine entsprechende tRNA besitzt, welche für die Aminosäure Glutamin codiert.

Für die Herstellung elektrokompetenter TG1-Zellen wurden diese aus einer Vorkultur in M9-MM-Medium mit einer OD⁶⁰⁰ von 0.01 in LB⁰-Medium angeimpft und bei 18°C bis zu einer OD⁶⁰⁰ von 0.2 bis 0.25 bei 220 rpm geschüttelt. Die Zellen wurden anschliessend einem dreiminütigen Hitzeschock bei 37°C unterworfen, erneut bei 18°C für 20 min geschüttelt und im Eisbad abgekühlt. Die eiskalte Bakterien-Suspension wurde in 50 ml Falcon-Tubes (Falcon, Heidelberg) überführt und bei 4°C für 5 min bei 2000 g abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 10 ml 7 %iger (v/v) DMSO-Lösung aufgenommen und erneut zentrifugiert.

Anschliessend wurde das Pellet 2x in 5 ml 7 % DMSO aufgenommen und abzentrifugiert.

Zuletzt wurden die Bakterien in je 500 µl DMSO-Lösung aufgenommen und in 100 µl-Ansätze aliquotiert. Bis zur weiteren Verwendung wurden die Bakterien auf Eis gelagert, wobei die Zeitspanne möglichst gering gehalten werden sollte. Um eine hohe Transformationseffzienz für die Herstellung einer Bibliothek zu erreichen, wurden die TG1-Zellen am Tag der Transformation hergestellt. Deweiteren wurde ein Teil der TG1-TG1-Zellen für Standard-Transformationen im flüssigem Stickstoff schockgefroren.

Alle Arbeiten zur Herstellung elektrokompetenter TG1-Bakterien wurden im Kühlraum mit vorgekühlten Materialien und Reagenzien durchgeführt.

6.4.2 Produktion von Phagenüberständen

Zur Produktion von Phagenüberständen wurden 10ml YT-AG-Medium in einem 50ml Falcon-Tube aus einer Glycerinkultur oder einer Kolonie TG1-Zellen, in die das gewünschte Konstrukt transformiert worden war, angeimpft und bei 37°C unter Schütteln bei 220rpm bis zu einer OD⁶⁰⁰ von 0.4 (frühe logarithmische Phase) inkubiert. Die TG1-Zellen wurden anschliessend mit 10¹⁰ cfu (colony forming units) des Helferphagen M13K07 (GE Healthcare, München) oder des Hyperphagen (Progen, Heidelberg) infiziert und weitere 30min unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Danach erfolgte durch Mediumwechsel eine zusätzliche Selektion auf den Helferphagen und das Phagmid. Hierzu wurden die Bakterien gewaschen (Zentrifugation bei 5500 g, 10 min, RT, Resuspendierung des Pellets in 5 ml YT-AK), pelletiert (5500 g, 10 min, RT) und in 10 ml YT-AK aufgenommen. Die Produktion der

Phagenüberstände erfolgte bei 30°C üN für Einzelphagenüberstände bzw. für 5 h bei Phagengemischen, um zu verhindern, dass einzelne Phagen aufgrund eines Selektionsvorteils überproportional häufig vertreten sind. Anschliessend wurden die Phagenüberstände bei 5500 g für 10 min pelletiert, durch einen 0.45 µm-Filter sterilfiltriert und bei 4°C zur direkten Weiterverwendung gelagert oder bei -20°C eingefroren.

6.4.3 Titration

Die Titration der Phagenüberstände konnte auf LB^Amp-Platten durchgeführt werden, da M13 kein lysogener Phage ist und dieser während der Infektion die Ampicillin-Resistenz des Phagemids erwirbt. Somit können infizierte Bakterien auf LB^Amp-Platten zu Kolonien heranwachsen. Der infektiöse Titer von M13-Phagen-Überständen kann daher als „Kolonie-bildende Einheiten pro ml‚ (colony forming units/ml = cfu/ml) angegeben werden.

Zur Titerbestimmung wurden TG1-Zellen aus einer M9-MM-Vorkultur in LB⁰-Medium überimpft, bei 37°C unter Schütteln bei 220rpm bis zu einer optischen Dichte von 0.4 bis 0.5 inkubiert und dann auf Eis maximal drei Tage gelagert. Bei jeder Titerbestimmung wurde stets ein Referenzphage zur Normierung (willkürlich gewählter Phagenüberstand mit der Bezeichnung „p6-9‚, Titer eingestellt auf 1x10¹² cfu/ml) mitgeführt. Die Phagenüberstände wurden seriell in LB⁰-Medium verdünnt (Verdünnungen 1:10⁴ bis 1:10⁷) und je 4 µl davon zu 200µl TG1-Zellen gegeben, die zuvor für 10 min bei 37°C inkubiert worden waren. Die Infektion erfolgte für 30min bei 30°C ohne Schütteln. Anschliessend wurden je 50 µl der Bakterien-Phagen-Suspension auf SOBAG-Platten ausplattiert und üN bei 30°C bebrütet. Der Titer errechnete sich nach folgender Formel:

Titer (cfu/ml) = Zahl der Kolonien x Verdünnungsfaktor x Korrekturfaktor / 0.004 ml Der Korrekturfaktor errechnete sich wie folgt:

Titer (cfu/ml) = [Titer (Phagen-Überstand X) / Titer (Phagen-Überstand p6-9)] x 10¹²

Die Titerbestimmung wurde in parallelen Ansätzen in Duplikaten durchgeführt und der Mittelwert bestimmt.

6.4.4 PEG-Fällung

Zur Aufkonzentrierung der Phagenüberstände wurden diese mit ⅕ Volumen einer PEG/NaCl-Lösung vermischt und 30 min auf Eis inkubiert. Anschliessend wurden die Ansätze 10min bei 14.000rpm und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das

Pellet in 5-fachen SDS-Probenpuffer für eine anschliessende SDS-PAGE mit Western Blotting aufgenommen.

6.4.5 Bio-Panning

Das Bio-Panning wurde zur Selektion hochaffiner SamR2 Varianten eingesetzt. Hierfür wurde das rekombinant hergestellte Zielprotein GST-Rev an magnetische Dynabeads (M-270 Epoxy Dynabeads, Invitrogen, Hamburg) gebunden und mit der SamR2-Phagenbibliothek inkubiert. Gebundene Phagen wurden nach intensivem Waschen durch einen pH-Sprung von den Dynabeads eluiert und zur Infektion und Amplifikation mit TG1-Zelllen inkubiert.

Hochaffine Varianten wurden durch DNA-Isolierung und Sequenzierung bestimmt.

Das Bio-Panning gliederte sich in drei Phasen: Coaten der Dynabeads, Phagenselektion, Re-Amplifizierung.

1. Coaten der Dynabeads:

100 µl Bead-Lösung wurden in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und in einem Magnetständer (Dynal Biotech GmbH, Hamburg) platziert, so dass der Überstand abgenommen werden konnte. Nach dreimaligem Waschen mit Bead-Puffer wurden 10 µg Protein in insgesamt 100 µl Bead-Puffer zu den Dynabeads gegeben und 50 µl einer Ammoniumsulfatlösung zugesetzt. Der Ansatz wurde üN auf einem Überkopfschüttler bei 4°C inkubiert.

2. Panning:

Zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen wurden die Beads 1 h bei RT mit 100 µl Blockingpuffer geschüttelt. Zugleich wurde die Phagenbibliothek oder der Phagen-Überstand aus einer früheren Runde (Titer > 10⁹ cfu/ml) 1:1 mit Blockingpuffer gemischt und 15 min bei RT geschüttelt. Nach einer Inkubationszeit von 1 h wurde der Überstand im Magnetständer wieder abgenommen, die Beads 3x mit je 1 ml Waschpuffer gewaschen und mit der PhagenVerdünnung 1 h unter Schütteln inkubiert. 10 µl der PhagenVerdünnung wurden für eine Titerbestimmung (Aliquot #1) abgenommen, der Rest wurde verworfen.

Zum Entfernen der unspezifisch oder schwach gebundenen Phagen wurden die Beads 10x mit je 1 ml Waschpuffer gewaschen. Die Elution erfolgte durch einen pH-Sprung auf 2.2 mit 100 µl Elutionspuffer bei RT für 10 min unter Schütteln. Die Phagenlösung wurde anschliessend im Magnetständer abgenommen und durch Zugabe von 30 µl 1 M Tris-HCl

pH 9.0 neutralisiert. Anschliessend wurde ein 10µl-Aliquot für eine Titerbestimmung (Aliquot #2) abgenommen.

3. Re-Amplifizierung:

Der selektionierte Phagenüberstand wurde zu 3 ml frischen TG1-Zellen OD⁶⁰⁰ 0.4 in ein 50 ml-Falcon-Tube gegeben (6.4.3). Die Infektion fand unter Schütteln bei 37°C für 45 min statt. Dann wurde eine Probe von 100 µl (Aliquot #3) entnommen; die restlichen infizierten TG1-Zellen wurden auf großen SOBAG-Platten ausplattiert und üN bei 30°C bebrütet. Am nächsten Tag wurden die Kolonien mit YT-AG-Medium von den Platten abgeschwemmt, auf eine OD⁶⁰⁰ von 0.4 eingestellt und die Phagenüberstände produziert (6.4.2).

Analyse:

Die produzierten Phagenüberstände wurden zur Qualitätskontrolle anschliessend titriert (6.4.3) und in eine neue Runde eingesetzt. Zur quantitativen Analyse des Bio-Pannings wurden ebenfalls die abgenommenen Phagenüberstände Aliquot #1-3 titriert. Hochaffine Varianten wurden aus einer Anzahl von Kolonien der SOBAG-Platten nach der Amplifikation durch DNA-Isolierung und Sequenzierung analysiert.

6.4.6 Phagen-ELISA

Die Affinität der amplifizierten Phagenüberstände aus den Panning-Runden sowie der einzelnen Varianten wurde mit einem Phagen-ELISA untersucht. Zur Auswertung wurde das Modell für eine Protein-Protein-Interaktion in Analogie zur Michaelis-Menten-Kinetik verwendet. Hierbei wird die Absorption (Menge gebundener Phagen) gegen den Titer in cfu/ml aufgetragen und ergibt eine typische Sättigungskurve bzw. bei halblogarithmischer Auftragung eine sigmoide Kurve.

Hierzu wurden 2 µg Protein (rekombinant hergestelltes GST-Rev) in 100 µl Coating-Puffer in jedes well einer 96-well MaxiSorp-Mikrotiterplatte gegeben und diese ÜN bei 4°C inkubiert.

Am nächsten Tag wurde die Platte 3x mit PBS/T gewaschen. Unspezifische Bindestellen wurden durch Inkubation mit je 200 µl Blocking-Puffer pro well für 2 h bei RT abgesättigt.

Nach Entfernen des Puffers und drei weiteren Waschschritten wurden in parallelen Ansätzen je 100µl einer Verdünnungsreihe der Phagenüberstände (1:4er-Schritte, in LB⁰ -Medium) beginnend bei 10¹² cfu/ml über 12 Stufen zugegeben und 1 h bei RT inkubiert.

Danach wurden überschüssige Phagen durch fünfmaliges Waschen entfernt. Anschliessend wurden je 100 µl eines 1:5000 in Blocking-Puffer verdünnten HRP-gekoppelten

Anti-M13-Antikörpers für 1 h zugegeben. Nach zehnmaligem Waschen wurden pro well 100 µl TMB-Substrat-Lösung zugegeben. Das Enzym HRP setzt das TMB-Substrat zu einem blauen Farbstoff um. Durch Zugabe von 50 µl 1N Schwefelsäure wurde die Reaktion abgestoppt, wodurch der Farbstoff nach gelb umschlägt. Die Absorption wurde mit einem Spektrophotometer (Biorad, Modell 680 Microplate Reader, München) bei 450 nm gemessen.