In dieser Arbeit wurden neben Datenbank-Suchen zur Genregulation auch biochemische Methoden zur Aufklärung der Funktion durchgeführt. Zusammenfassend konnte zum Beispiel für PPL1 gezeigt werden, dass das Gen am stärksten in den Petalen der Blütenentwicklungsphase 15 exprimiert ist, dass das Protein ein MAP Kinase Substrat ist und mit Histon 3 interagieren kann. Um einen weiteren Punkt zur Verknüpfung der bekannten Informationen hinzuzufügen, wurde eine phänotypische Untersuchung von ppl1, ppl2 und ppl1ppl2 Mutanten durchgeführt (2.2.4.6, Anhang 8). Da die ppl1_SALK T-DNA Linie kein reduzierter Transkriptlevel zeigte, wurde mittels CRISPR Cas9 Verfahren (2.2.4.4) eine ppl1 Linie generiert. Nach Sequenzierung zeigte, dass die ppl1 Linie ein stark verkürztes Translationsprodukt von 9 Aminosäuren durch ein frühzeitiges Stop-Codon generiert. Dies wird durch eine Nukleotid-Insertion nach bp 20 durch die Verschiebung des Leserasters hervorgerufen (Anhang 8 C). Bei der phänotypischen Untersuchung konnten keine optisch sichtbaren Unterschiede bei der Keimung, Blattbildung und Infloreszenzbildung unter Lang- oder Kurztag Bedingungen beobachtet werden. Unter Langtag-Bedingungen zeigten sich jedoch für ppl1 Pflanzen vergrößerte Blütenstände im Vergleich zu Col-0 Pflanzen (Abbildung 24 A). Zur analytischen Auswertung dieser Beobachtung wurden Blüten (Entwicklungsstufe 14) der vier untersuchten Linien geerntet und die Petalen separiert (Alvarez-Buylla, Benítez et al. 2010). Mit Hilfe der Vermessung der Petalen-Flächen konnte gezeigt werden, dass Pflanzen der ppl1 Linie im Vergleich zu Col-0 unter Langtag Bedingungen Blüten mit vergrößerten Petalen aufweisen (Abbildung 24 B).
Im Vergleich dazu konnte sowohl für ppl2 Blüten als auch für ppl1ppl2 Blüten unter Langtag Bedingungen keine Unterschiede zu Col-0 detektiert werden. Neben der Fläche wurden auch die Länge und Breite der Petalen gemessen. Dies diente der Untersuchung ob den vergrößerten Flächen der ppl1 Petalen ein verstärktes Längen- oder Breitenwachstum zur Grunde liegt.
67 Anhand der Daten konnte jedoch gezeigt werden, dass die ppl1 Petalen unter Langtag einheitlich länger und breiter waren (Abbildung 24 B). Zur weiteren Einordnung dieses Effektes wurden ebenfalls Blüten der ÜE 5-6 HA-PPL1 Überexpressionslinie untersucht. In
Abbildung 24 Darstellung der intakten Blüten sowie Fläche, Breite und Länge von Petalen der Blüten von Col-0, ppl1, ppl2 und ppl1ppl2. Die Anzucht der Pflanzen bis zur Blüte erfolgte einerseits in 3 unabhängigen Experimenten unter Langtag Bedingungen (A, B) und in einem Experiment unter Kurztag Bedingungen (A, C).
Die intakten Blüten wurden fotografiert (A). (B, C) Die Petale wurden von den weiteren Bestandteilen der Blüten separiert und mit Hilfe von ImageJ analysiert. (B) Zur statistischen Auswertung wurde eine One-way ANOVA mit Dunn´s Post Test durchgeführt. n ≥ 50 Petale (je 4 Pflanzen, 1-2 Blüten pro Pflanze) (C) n ≥ 3 (je 1-2 Pflanze, 1-2 Blüten pro Pflanze).
68 diesem einzelnen Experiment unter Langtag Bedingungen konnten ebenfalls vergrößerte Petale gemessen werden (Anhang 11). Dies gibt möglicherweise einen Hinweis darauf, dass eine generelle Misregulation zur Ausprägung dieses Phänotyps führt.
Aus Zeitgründen konnte die Anzucht bis zur Blüte der vier Linien nur einmal unter Kurztag Bedingungen erfolgen. Die ppl1 Blüten zeigten einen vergleichbaren Phänotyp wie unter Langtag Bedingungen. Im Gegensatz zu den Langtag Bedingungen konnten hingegen für ppl2 und ppl1ppl2 kleinere Blütenstände im Vergleich zu Col-0 unter Kurztag Bedingungen beobachtet werden (Abbildung 24 A). Diese Beobachtungen werden durch die Bestimmung von Fläche, Länge und Breite der Petalen unterstützt, konnten jedoch aufgrund der einmaligen Durchführung nicht statistisch abgesichert werden (Abbildung 24 C). Dieses spezifische Verhalten gibt einen Hinweis darauf, dass vermutlich beide Proteine in ähnlichen regulatorischen Netzwerken aber unter verschiedenen Bedingungen vertreten sind.
Zur weiteren Analyse der Ursache der vergrößerten ppl1 Petalen wurden einzelne Petale der vier Pflanzenlinien entfärbt und anschließend licht-mikroskopisch untersucht. Durch die unregelmäßige Form wurde in dieser Arbeit eine indirekte Bestimmung der Größe der Zellen gewählt. Hierbei wird die Anzahl der Zellen pro definierte Fläche ausgezählt und geben damit einen reziproken Wert der Zellgröße an. Dadurch kann über die Bestimmung der Zellanzahl Aussagen über die Größe der Zellen getroffen werden (Cheng et al., 2014). Dafür wurden Petale der Pflanzen aus einem Langtag und einem Kurztag Versuch verwendet. Es war deutlich zu beobachten, dass die Zellen der ppl1 Petalen sowohl unter Kurztag als auch unter Langtag Bedingungen größer als Col-0 Zellen waren (Abbildung 25). Wie auch schon bei der Größenbestimmung der Blütenblätter konnte für ppl2 und ppl1ppl2 ein Unterschied zwischen der Anzucht unter Lang- und Kurztag Bedingungen beobachtet werden. Unter Langtag Bedingungen zeigten beide Genotypen keine Unterschiede zu den Col-0 Pflanzen beziehungsweise den ausgezählten Zellzahlen (Abbildung 25 A). Unter Kurztag Bedingungen konnten deutlich mehr Zellen pro Fläche gezählt werden (Abbildung 25 B). Diese Werte stimmen mit den optischen Beobachtungen der intakten Blütenstände überein (Abbildung 24 A).
69 In phänotypische Untersuchungen von Col-0, ppl1, ppl2, ppl1ppl2 und PPL1 ÜE 5-6 Pflanzen konnten vergrößerte Petalen bei ppl1 und ÜE 5-6 beobachtet werden, die durch ein verstärktes Zellwachstum hervorgerufen werden. Im Gegensatz dazu konnten für ppl2 und ppl1ppl2 unter Kurztag Bedingungen in einem ersten Experiment Blüten mit kleineren Petalen, hervorgerufen durch vermindertes Zellwachstum, beobachtet werden. Dieser Phänotyp scheint spezifisch für Kurztag Bedingungen zu sein, da unter Langtag Bedingungen keine Unterschiede zu Col-0 Blüten auftraten.
Abbildung 25 Darstellung der Zellzahl pro 0,1 mm2 Petalenfläche für Col-0, ppl1, ppl2 und ppl1ppl2. Die Anzucht der Pflanzen bis zur Blüte erfolgte in einem unabhängigen Experiment unter Langtag und Kurztag Bedingungen. Zur Auszählung der Zellzahl wurden die separierten Petale entfärbt und lichtmikroskopisch untersucht. Die Zählung erfolgte manuell in einem standardisierten Quadrat von 0,1 mm x 0,1 mm in ImageJ.
Zur statistischen Auswertung wurde eine One-way ANOVA mit Dunn´s Post Test durchgeführt. Langtag n = 9, Kurztag n=6 (jeweils 2 Pflanzen, je 1 Blüte)
70