2. ERGEBNISSE
2.4 Phänotyp von glykolipiddefizienten Mutanten
Mit Hilfe dieser Stämme konnte nun nach weiteren Phänotyp-Unterschieden gesucht werden, um Hinweise auf die biologischen Funktionen der Glykolipide zu erhalten. Aus der Literatur (Carillo et al., 1996) war bereits bekannt, dass Glykolipide aufgrund ihrer Oberflächenaktivität auf Blutagarplatten eine hämolytische Wirkung besitzen können.
Hierbei kommt es zum Platzen der Erythrozyten, wodurch ein klarer Hof um die Kolonie entsteht. Abbildung 11 zeigt das Ergebnis des Hämolysetests. Es wurden die beiden
Wildtypstämme FB1 und MB215 und die jeweiligen Deletions- und Doppelmutanten untersucht.
Abb. 11: Untersuchung der hämolytischen Aktivität der Wildtypstämme, der Deletions- und Doppelmutanten. Die Hämolyse wurde nach zwei Tagen Inkubation auf Blutagarplatten untersucht. Bei den Wildtypstämmen und den ∆cyp1 Deletionsmutanten konnte eine deutliche Hämolyse beobachtet werden.
Die beiden Wildtypstämme zeigten Hämolyse, wobei die hämolytische Wirkung von MB215 wesentlich stärker war als die von FB1. Dieses Ergebnis korrelierte mit der erhöhten Glykolipidproduktion von MB215 im Vergleich zu der von FB1 (Hewald et al., 2005). Die Deletion von cyp1 bewirkte keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zu den Wildtypstämmen. Im Gegensatz dazu zeigten die ∆emt1 und die ∆emt1∆cyp1 Stämme nur noch eine sehr schwache Hämolyse auf den Blutagarplatten. Diese Ergebnisse lassen die Schlussfolgerung zu, dass die Ustilaginsäure keine signifikante hämolytische Aktivität aufweist, während die Mannosylerythritollipide eine starke hämolytische Wirkung besitzen.
Die Restaktivität der ∆emt1 und der ∆emt1∆cyp1 Stämme ist vermutlich auf andere Substanzen, wie hämolytisch wirkende Proteine, zurückzuführen.
Glykolipide setzen als amphipathische Substanzen die Oberflächenspannung von Flüssigkeiten herab. Dies wurde in einem Test für die zur Verfügung stehenden Deletions- und Wildtypstämme überprüft (Abb. 12) (Kuiper et al., 2004).
Hierzu wurden die verschiedenen MB215 Deletionstämme, der Wildtypstamm und eine Doppelmutante (SH6∆emt1∆cyp1) unter Stickstoffmangel für fünf Tage inkubiert. Von den Kulturüberständen der verschiedenen Ansätze wurde jeweils ein Aliquot abgenommen, mit dem Farbstoff Xylencyanol angefärbt und auf eine hydrophobe Oberfläche (Parafilm) getropft. Der Farbstoff hatte hierbei keine Auswirkungen auf die Form der Tropfen und wurde nur zur besseren Visualisierung verwendet. Als Kontrolle wurde zudem frisches Medium getropft.
Abb. 12: Untersuchung der Oberflächenaktivität der sekretierten Glykolipide.
Extrazelluläre Glykolipide sind in der Lage, die Oberflächenspannung von Kulturüberständen zu reduzieren. Kulturüberstände wurden auf eine hydrophobe Oberfläche getropft (Parafilm). Bei einer flachen Tropfenform liegt eine niedrige Oberflächenspannung und bei einer runden Tropfenform liegt eine hohe Oberflächenspannung vor. Frisches Medium diente als Kontrolle. Der Überstand der emt1 Deletionsmutante zeigte eine sichtbare Reduzierung der Oberflächenspannung, allerdings bewirkten die Überstände der cyp1 Deletionsmutante und des Wildtypstammes eine deutlich stärkere Reduzierung der Oberflächenspannung.
Es zeigte sich, dass der Kulturüberstand des Wildtyp-Stammes MB215 eine sehr niedrige Oberflächenspannung aufwies. Der Überstand einer ∆cyp1 Kultur zeigte eine fast ebenso starke Reduzierung. Im Gegensatz dazu konnte man für den Überstand des ∆emt1 Stammes nur eine leichte reduzierte Oberflächenspannung erkennen. Der Überstand der
Doppelmutante, wie auch das glykolipidfreie Medium wiesen eine normale, starke Oberflächenspannung auf. Die Ustilaginsäure hat also eine geringere Auswirkung auf die Oberflächenspannung, als die sekretierten Mannosylerythritollipide.
Eine weitere potentielle Funktion der amphiphatischen Glykolipide könnte in einer Unterstützung der Ausbreitung der hydrophoben Pheromone über größere Distanzen auf hydrophoben Oberflächen liegen (wie zum Beispiel auf der Blattoberfläche von Maispflanzen)). Dies wurde in einem Konfrontationstest überprüft (Snetselaar et al., 1996).
Hierzu wurden angereicherte Kulturen der zu untersuchenden Stämme auf Wasseragar (hydrophil) aufgetropft und mit Paraffinöl (hydrophob) bedeckt. Dies sollte die natürliche Umgebung widerspiegeln, da dort ähnliche Grenzflächen zwischen der hydrophoben Pflanzenoberfläche und dem mit Wasser gefüllten Blattwirtel zu finden sind. Die kompatiblen Wildtyp- und Deletionsstämme wurden in < 1 mm Abstand angeordnet.
Abbildung 13 zeigt die Ergebnisse nach einer 16-stündigen Inkubation. Die beiden kompatiblen Wildtypstämme FB1 und MB215 bildeten deutlich Konjugationshyphen aus, die auf dem Wasseragar gerichtet aufeinander zuwachsen können (Abb. 13, Pfeil).
Abb. 13: Konfrontationstest zur Überprüfung der Pheromonausbreitung über große Distanzen. Kompatible Stämme wurden auf Wasseragar in sehr geringer Entfernung aufgetropft und mit Paraffinöl bedeckt. Die Ausbildung von gerichteten Konjugationshyphen konnte nur bei den Wildtypstämmen (FB1 und MB215) und den
∆emt1 Stämmen beobachtet werden.
Die beiden kompatiblen emt1 Deletionsstämme waren ebenfalls in der Lage, aufeinander zuwachsende Konjugationshyphen auszubilden (Abb. 13, Pfeilspitze), welche jedoch im Vergleich zu den Hyphen der Wildtypstämme im Bereich der Kolonien verklebt erschienen.
Die beiden kompatiblen cyp1 Deletionsstämme waren nicht mehr in der Lage, aufeinander zuwachsende Konjugationshyphen auszubilden.
Interessanterweise zeigten die beiden Doppeldeletionsmutanten, welche ebenfalls unterschiedliche Kreuzungstypen besitzen, eine Kombination beider Phänotypen. So konnten die Konjugationshyphen nicht gerichtet aufeinander zuwachsen, und die schienen genauso verklebt zu sein, wie die Hyphen der ∆emt1 Mutanten. Diese Ergebnisse zeigten, dass der Ustilaginsäure vermutlich eine größere Bedeutung für die Ausbreitung der hydrophoben Pheromone über große Distanzen zukommt als den Ustilipiden.
Bei Kreuzungs- und dem Pathogenitätstests konnten keinerlei Unterschiede zwischen den Wildtypstämmen FB1 und MB215 und den kompatiblen Doppelmutanten SH6∆emt1∆cyp1 und SH9∆emt1∆cyp1 festgestellt werden (Abb. 14 A; 14 B und Tab. 2). So waren die Doppelmutanten genauso wie die Wildtypstämme in der Lage, auf aktivkohlehaltigen Agarplatten miteinander zu kreuzen, was an dem gebildeten weißlichen Myzel, den dikaryotischen Filamenten, zu erkennen war. Zudem gab es keine signifikanten Unterschiede bei der Tumorausbildung. Der Verlust der Glykolipidproduktion scheint also keine Auswirkungen auf die Pathogenität zu haben.
Abb. 14: Überprüfung des Kreuzungsverhaltens der Doppeldeletionsmutanten (A).
Die Doppeldeletionsmutanten zeigten keinen Unterschied in ihrem Kreuzungsverhalten im Vergleich zu den Wildtypstämmen. Sie sind immer noch kreuzungsfähig. Test auf Pathogenität (B). Die Doppelmutanten zeigten im Vergleich zu den Wildtypstämmen keine Unterschiede in der Tumorausbildung.
Tab. 2: Übersicht über den Pathogenitätstest der beiden Wildtypstämme FB1 und MB215 und der Doppeldeletionstämme ∆emt1∆cyp1.