2. EKSPERIMENTAALNE OSA
2.3 Tulemused
2.3.4 p53 ekspressioon ja lokalisatsioon DEN indutseeritud hiire maksakasvaja
p53 on oluline tuumor-supressor geen. p53 valgu hulka hoiavad rakus madalana erinevad negatiivsed regulaatorid. Rakkudes, mis on mõjutatud paljude stressisignaalide poolt, võib p53 hakata kuhjuma. Sellised muutused võivad viia kartsinogeneesi tekkeni. Katsetulemused on tootud järgneval joonisel (Joonis 9.).
38
Joonis 9. p53 valgu ekspressioon ja lokaliseerumine. Võrreldes PBS- ja DEN-süstitud hiirte maksalõike erinevates ajapunktides, ei saa täheldada p53 valgu ekspressiooni ja lokalisatsiooni muutust. Nii DEN indutseeritud vigastusega, kui ka kontrollhiirte maksalõikudes on valk ekspresseeritud peamiselt rakumembraanis.
39 2.4 Arutelu
Maks on inimorganismi üks kesksemaid organeid ning sellega seotud haigused on tihtipeale raskekujulised. Maksavähki esineb erinevates vormides, kuid kõige enamlevinud vähitüübiks on hepatotsellulaarne kartsinoom, mis moodustab 90% kõikidest maksavähi juhtudest. Vähk võib alguse saada nii eelneva kahjustusega maksast nagu näiteks maksatsirroosist, kui ka tervest ilma kahjustuseta maksast. HCC kujunemises ja tekkes on oluline erinevate signaaliradade aktivatsioon. Sellest lähtvalt püstitati käesoleva uurimistöö eksperimentaalses osas eesmärk uurida kas ja kuidas muutub DEN indutseeritud hiire maksakasvaja mudelis Wnt, Hedgehog ja Notch signaaliradade ning p53 ja AKT valgu aktiivsus kasvaja arengu käigus.
Esmalt süstiti hiiri DEN-ga, et indutseerida hepatotsellulaarse kartsinoomi teket.
Dietüülnitrosamiin on kartsinogeen, mis tekitab mutatsioone DNAs ja kasvajaid, näiteks maksas ja seedeelundkonnas. (Parka et al., 2009: Varna et al., 1996) Kontrollgrupi hiiri süstiti PBS-ga. Proove koguti 5., 12. ja 25. nädala vanustelt hiirtelt, kelle maksadest eraldatud RNAsid analüüsiti RT-qPCR meetodiga. Kõiki katseid korrati kolm korda ning tulemustest arvutati aritmeetiline keskmine. PCR-ga saadud tulemusi analüüsides võrreldi kuidas muutub Notch, Hedgehog ja Wnt signaaliradade aktiivus DEN indutseeritud kahjustusega kasvajamudelis ja PBS-ga süstitud kontrollgrupis. Kokku uuriti nendes signaaliradades 13 geeni, mille aktiivsust või aktiivsuse vähenemist on täheldatud kasvaja arengus. Hedgehog signaalirajas uuriti geene Shh, mis kodeerib kõige enam ekspresseeritud ligandi Shh, mis avaldub ainult vähikoldes, mitte ümbritsevas koes. (Echelard et al., 1993; Johnson et al., 1994; Riddle et al., 1993) Lisaks uuriti geene Ptch1, Gli1 ja Gli2. Gli geeniperekonna geenid on olulised sihtmärkgeenide ekspressioonis. (Carney ja Ingham, 2013) Sarnaselt Shh-le on Gli1 ekspresseeritud vähikoldes.
(Ruppert et al., 1991) PTCH1 valk, mida kodeerib Ptch1 geen, on Hedgehog signaalirajas retseptor. (Ingham, 1998; Ingham et al., 1991) Wnt signaalirajas uuriti tüvirakumarkerit ja märklaudgeeni Lgr5 ning Axin2, mis on olulne β-kateniini taseme kontrollis. Aksiini geeni funktsiooni kadumine põhjustab β-kateniini valgu kuhjumist, mis indutseerib kasvajate teket.
(Liu et al., 2000) Notch signaalirajas vaadeldi Notch1 ja Notch3 geene, mis kodeerivad retseptoreid ning sihtmärkgeene Hey1, Hes1, Trib2, Ccnd1 ja Tbp1. Uuritavate geenide mRNA tase normaliseeriti koduhoidja geeni Gapdh suhtes. Analüüsides RT-qPCR tulemusi (Lisa 2, joonis 1.) on näha, et üheski uuritud geenis ei esine statistilist olulisust PBS-ga süstitud kontrollhiirte ja DEN indutseeritud kahjustusega hiirte vahel. Ekspressioonitasemetes esineb erinevusi, kuid kuna katsetulemuste veapiirid langevad kokku ei saa tuua välja olulisi muutusi.
See lubab oletada, et 25. nädalaks ei ole hepatotsellulaarne kartsinoom jõudnud välja kujuneda.
40
Lisaks vaadeldi töös p53 ekspressiooni, AKT valgu fosforüleeritust positsioonides S-473 ja T-308 ning β-kateniini lokalisatsiooni. Selleks analüüsiti hiiremaksadest valmistatud külmutatud koelõigud immunofluorestsents analüüsi meetodil.
p53 valku vaadeldi seepärast, kuna eelnev kirjandus hepatotsellulaarses kartsinoomis esinevate mutatsioonide, onkogeenide ja tuumorsupressorite kohta näitab, et ühes kõige sagedamini muteerunud geeniks on TP53. (Moeini et al., 2012) TP53 aktiveerub kui ekspressioon lokaliseerub membraanist tuuma Analüüsides tulemusi (Joonis 9.) on näha, et tuuma lokaliseerumist ei toimu. Tervete maksade (PBS-ga süstitud hiired) puhul on selline tulemus oodatav, kuid kahjustusega hiirtes mitte, sest DEN tekitab rakkudele kahjustuse. Seega saab taaskord eeldada, et 25. nädalane ajapunkt on valitud liiga varajane, et jõuaks välja kujuneda hepatotsellulaarne katsinoom või on vähi areng liiga varajases staadiumis.
β-kateniin on Wnt signaalirajas oluline valk ning see on tihedalt seotud Axin2 geeni ekspressioonitasemega. β-kateniini stabiilsuse regulatsioonis on oluline AXIN2 valk, mille funktsiooni kadumine toob endaga kaasa β-kateniini kuhjumise. See võib põhjustada soolestiku kasvajate teket. β-kateniin mutatsioone on sagedasti leitud erinevatest kasvajatest aga eelkõike HCC-st. (Liu et al., 2000) Kui β-kateniini kuhjumine oleks käesoleva kasvajamudeli põhjuseks, peaks selle ekspressioonitase hilisemates ajapunkides kasvama ning signaal peaks lokaliseeruma membraanist tuuma. Kuna antud töös saadud tulemustes ei ole β-kateniini lokalisatsioon DEN-süstitud hiirte maksades võrreldes kontrollhiirtega muutunud, siis pole tõenäoliselt Wnt signaalirada oluline käesoleva kasvajamudeli tekkimises.
PI3K/AKT signaaliraja ebanormaalset aktivatsiooni on kirjeldatud soolestiku- ja maksakasvajate tekkes. (Taniguchi et al., 2010) Fosforüleerimissaidi S-473 aktiivsust ei saa täheldada. (Lisa 3., joonis 2.) Katsetulemused pAKT-S308 antikehaga (Joonis 8.) näitavad, et 25. nädal on DEN indutseeritud kahjustusega lõikudel fosforüleeritud aktiivne Akt liikunud tuuma. See näitab, et PI3K/AKT signaaliraja aktiivsus on tõusnud.
Analüüsides tulemusi ning toetudes eelnevale kirjandusele saab väita, et valitud ajapunktid olid liiga varajased, et saaks täheldada väljakujunenud hepatotsellulaarset kasvajat. Katsed 33.
nädala vanusest CBA hiirest eraldatud primaarse maksakasvaja rakuliini K07074-ga näitavad, et tõusnud on aktiivsus Notch, Hedgehog, AKT ja Wnt signaalirajas. (Mäemets-Allas et al., 2016).
Nendest tulemustest võib järeldada, et hetkel on selgusetu, mis on käesolevas uurimistöös kasutatud kasvajamudeli tekkepõhjuseks. Katseid tuleks korrata hilisemates ajapunktides.
41 KOKKUVÕTE
Maksal on organismis tähtis roll, mistõttu on selle organiga seotud haigused raskekujulised või letaalsed. Surmaga lõppevatest haigustest on maksavähk on maailmas kolmandal kohal.
Olenevalt vähi tüübist võivad kartsinogeneesi põhjused olla erinevad. Täpsed kartsinogeneesi molekulaarsed mehhanismid on teadmata, kuid on näidatud erinevate signaaliradade, näiteks Hedgehog, Notch ja Wnt, aktivatsiooni vähi tekkes ja kujunemises. Käesoleva töö eesmärgiks oli uurida kas ja kuidas muutub DEN-indutseeritud hiire maksakasvaja mudelis Wnt, Hedgehog ja Notch signaaliradade ning p53 ja AKT valgu aktiivsus kasvaja arengu käigus.
Esmalt süstiti isaseid CBA hiiri DEN-ga, et indutseerida hepatotsellulaarse kartsinoomi teke.
Maksaproove koguti 5, 12 ja 25 nädala vanustelt hiirtelt. Maksadest eraldati RNA ning sooritati RT-qPCR, et analüüsida Hedgehog, Wnt ja Notch signaalirajas oluliste geenide aktivatsiooni.
Igas ajapunktis analüüsiti vähemalt 3 DEN indutseeritud ja 3 PBS-ga süstitud kontrollhiirt.
Kõiki katseid sooritati kolmes korduses. Võrreldes omavahel signaaliradade geenide ekspressiooni PBS ja DEN süstitud hiirtel erinevates ajapunktides, ei saa öelda, et tulemuste erinevused oleksid statistiliselt olulised, sest katsetulemuste veapiiridel esineb kokkulangevus.
Seega võib väita, et antud signaalirajad ei mängi uuritud kasvajamudeli kartsinogeneesis olulist rolli. Põhjuseks võivad olla muud signaalirajad või oleks pidanud koguma proove hilisematelt ajapunktidelt kui 25 nädalat.
Immuunofluorestsents analüüsiga uuriti p53 ja AKT valgu ekspressiooni ja lokaliseerumist.
Mutatsioonid p53 signaalirajas viivad p53 valgu kuhjumiseni, mis omakorda võib põhjustada kasvaja teket. Aktiivne PI3K/AKT signaalirada on oluline rakkude ellujäämiseks, kusjuures inaktiivne signaalirada tekitab apoptoosi. Maksa- ja soolestikukasvajate puhul on kirjeldatud AKT signaaliraja ebanormaalset aktivatsiooni. p53, AKT1 ja β-kateniin olid nii PBS- kui ka DEN-süsitud hiirte koelõikudel ekspresseeritud rakumembraanis. Et saaks täheldada antud geenide aktivatsiooni peab signaal lokaliseeruma tuuma. Vaadeldes T-308 antikehadega töödeltud lõike, on 25. nädalal näha, et fosforüleeritud aktiivne Akt lokaliseerub tuuma, mis näitab, et 25. nädalaks on AKT signaaliraja aktiivsus tõusnud.
Uurimistöös analüüsiti kõige tõenäolisemaid maksakasvajat põhjustavaid signaaliradasid, kuid täheldada sai vaid PI3K/AKT signaaliraja T-308 aktivatsiooni. Sellest väljendub, et antud töös kasutatud kasvajamudeli tekkepõhjuseks on muud signaalirajad. Samuti võisid olla valitud liiga varajased ajapunktid ning statistilisi erinevusi geeniekspressioonis ei ole jõudnud veel tekkida.
42
Characterization of tumor-specific signaling pathways in DEN-induced liver tumor model
Anett-Hildegard Laarmann
SUMMARY
Liver is one of the biggest glandular organ that carries vital role regulating the metabolism. In addition, it functions as immunogenic organ, as endocrine organs, excreting the bile, and as phagocytic organ, breaking down toxins. Liver cancer is the third largest cause of fatal cases worldwide. Depending on the type of cancer, causes of carcinogenesis may be different. Exact molecular mechanisms are unknown, but activation of different signaling pathways has been shown. For example, Hedgehog, Notch, Wnt and PI3K/AKT signaling pathways play important role in carcinogenesis. p53 acts as a tumor-supressor. Mutations in this gene could cause accumulation of p53 protein- that could lead to development of cancer. The aim of the current study was to examine whether and how does Wnt, Hedgehog and Notch signaling pathways and also p53 and AKT protein activity change in DEN induced mouse liver cancer model.
First, male CBA mice were injected with DEN, in purpose to cause development of hepatocellular carcinoma. Samples were collected on 5th, 12th and 25th week. RNA was isolated and RT-qPCR was performed to analyse gene expression in Wnt, Hedgehog and Notch pathways. Comparing results in DEN and in PBS injected control mice, no statistically important difference was detected. It indicates, that studied signaling pathways were not the cause of cancer in DEN induced tumor development model.
Next, mouse liver derived cryo sections were stained with p53, β-catenin, T-308, S-473 and AKT1 antibodies. Observing tissue samples stained with T-308, on 25th week phosphorylated active Akt localises into nucleus. It shows that activity of PI3K/AKT pathway has been up-regulated. Samples stained with p53, β-catenin, T-473 and AKT1 antibodies shows gene expression only in cell membranes.
To conclude, this study analysed activation of signaling pathways that could cause hepatocellular carcinoma. According to the results, only T-308 expression in PI3K/AKT pathway was shown to be activated. It indicates, that other signaling pathways researched in this study were not the cause of developing cancer model used in this thesis or we collected saples to early and statistical difference in gene expression has not happened yet.
43 KASUTATUD KIRJANDUS
Abdel-Misih, S. R. Z., Bloomston, M. (2010). Liver Anatomy. Surgical Clinics of North America 90 (4): 643-53
Al-Hajj, M., F Clarke, M. F. (2004). Self-renewal and solid tumor stem cells. Oncogene 23, 7274–7282.
Artavanis-Tsakonas, S., Rand, M. D., Lake, R. J. (1999). Notch signaling: cell fate control and signal integration in development. Science. 284(5415):770-6
Belitškin, D. (2013). Regulation of adult stem cells in mouse liver tumorigenesis. Magistritöö.
Tartu Ülikool. Molekulaar- ja rakubioloogia instituut. Lk. 15-17
Belloni, E. et al. (1996). Identification of Sonic hedgehog as a candidate gene responsible for holoprosencephaly. Nature Genet 14(3): 353-6
Bitgood, M. J., McMahon, A. P. (1995). Hedgehog and Bmp genes are coexpressed at many diverse sites of cell-cell interaction in the mouse embryo. Dev Biol. 172(1):126-38
Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. (1996). Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Curr. Biol. 6: 298-304.
Bloch, E.H. (1970). The termination of hepatic arterioles and the functional unit of liver as determined by microscopy of the living organ. Annals of the New York Academy of Sciences.
170: 78-87
Blumgart, L. H., Belghiti, J. (2007). Surgery of the liver, biliary tract, and pancreas, 3rd ed.
Elsevier. Philadelphia. Lk. 3-30
Bonnet, D., Dick, J. E. (1997). Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med. 3(7):730-7
Brou, C. et al. (2000). A novel proteolytic cleavage involved in Notch signaling: the role of the disintegrin-metalloprotease TACE. Mol Cell. 5(2):207-16
Bucher, N. L. R. (1967). Experimental Aspects of Hepatic Regeneration. New Eng. J. Med.
227:686. 738
Busuttil, R. W., Klintmalm, G. B. (2014). Transplantation of the liver, 3rd ed. Elsevier. USA.
Lk. 25-29
44
Carney, T. J., Ingham, P. W. (2013). Drugging Hedgehog: signaling the pathway to translation.
BMC Biology. 201311:37
Cheung, M., Testa, J. R. (2013). Diverse mechanisms of AKT pathway activation in human malignancy. Curr Cancer Drug Targets. 13(3):234-44
Chew, B. S., Siew, W. L., Xiao, B., Lehming, N. (2010).Transcriptional activation requires protection of the TATA-binding protein Tbp1 by the ubiquitin-specific protease Ubp3.
Biochemical Journal. 431(3). 391-402
Clement, V. et al. (2007). HEDGEHOG-GLI1 signaling regulates human glioma growth, cancer stem cell self-renewal, and tumorigenicity. Curr Biol. 17(2):165-72
Craig, J. R. et al. (1980). Fibrolamellar Carcinoma of the Liver: A Tumor of Adolescents and Young Adults with Distinctive Clinico-pathologic Features. Cancer. 46:372-379
Dang, T. P. et al. (2000). Chromosome 19 translocation, overexpression of Notch3, and human lung cancer. J Natl Cancer Inst. 92(16):1355-7
Davidoff, A. M., Humphrey, P. A., Iglehart, D., Marks, J. R. (1991). Genetic basis for p53 overexpression in human breast cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 88. 5006-5010
de Lau W. et al. (2011). Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling. Nature. 476: 293-297
Diehl, N., Schaal, H. (2013). Make Yourself at Home: Viral Hijacking of the PI3K/Akt Signaling Pathway. Viruses 5(12). 3192-3212
Downward, J. (2004). PI3-kinase, Akt and cell survival. Semin Cell Dev Biol. 15(2):177-82 Echelard, Y. et al. (1993). Sonic Hedgehog, a Member of a Family of Putative Signaling Molecules, Is Implicated in the Regulation of CNS Polarity. Cell. Vol. 75, 1417-1430
Eggert, T., McGlynn, K. A., Duffy, A., Manns, M.P. , Greten, T.F., Altekruse, S. F. (2013).
Fibrolamellar hepatocel-lular carcinoma in the USA, 2000–2010: A detailed report on frequency, treatment and outcomebased on the surveillance, epidemiology, and end results database. United European Gastroenterol J. 1:351–357
Ehtesham, M. et al. (2007). Ligand-dependent activation of the hedgehog pathway in glioma progenitor cells. Oncogene. 26(39): 5752-61
Ellisen, L. W. et al. (1991). TAN-1, the human homolog of the Drosophila notch gene, is broken by chromosomal translocations in T lymphoblastic neoplasms. Cell. 66(4):649-61
45
El-Serag, H. B. (2011). Hepatocellular Carcinoma. N Engl J Med. 365:1118-27
Espinoza, I., Miele, L. (2013). Notch inhibitors for cancer treatment. Pharmacol Ther.
139(2):95-110
Eyler, C. E., Rich, J. N. (2008). Survival of the Fittest: Cancer Stem Cells in Therapeutic Resistance and Angiogenesis. J Clin Oncol. 10; 26(17): 2839–2845
Fearon, E. R., Vogelstein, B. (1990). A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell.
61(5):759-67
Forner, A., Llovet, J. M., Bruix, J. (2012). Hepatocellular carcinoma. Elsevier Ltd.
379(9822):1245-55.
Fresno Vara, J. A. et al. (2004). PI3K/Akt signalling pathway and cancer.Cancer Treat Rev.
30(2):193-204.
Gonzalez, E., McGraw, T. E. (2009). The Akt kinases: isoform specificity in metabolism and cancer. Cell Cycle. 15; 8(16): 2502–2508
Haegebarth, A., Clevers, H. (2009). Wnt Signaling, Lgr5, and Stem Cells in the Intestine and Skin. Am J Pathol. 174(3): 715–721
Hanahan, D., Weinberg, R. A. (2000). The Hallmarks of Cancer Review. Cell, Vol. 100. 57–
70
Harris, S. L., Levine, A. J. (2005). The p53 pathway: positive and negative feedback loops.
Oncogene 24, 2899–2908
Honeyman, J. N. et al. (2014). Detection of a recurrent DNAJB1-PRKACA chimerictranscript in fibrobrolamellar hepatocellular carcinoma. Science. 343:1010–1014
Ingham, P. W. (1998) Transducing Hedgehog: the story so far. EMBO J. 17(13):3505-11 Ingham, P. W., McMahon, A. P. (2001). Hedgehog signaling in animal development:
paradigmas and principles. Genes Dev. 15: 3059-3087
Ingham, P. W., McMahon, A. P. (2001). Hedgehog signalling in animal development:
paradigms and principles. Genes Dev. 15, 3059–3087
Ingham, P. W., Taylor, A. M., Nakano, Y. (1991). Role of Drosophila patched gene in positional signaling. Nature. 353, 184–187
46
Johnson, R. L., Riddle, R. D., Laufer, E., Tabin, C. (1994). Sonic hedgehog: a key mediator of anterior-posterior patterning of the limb and dorso-ventral patterning of axial embryonic structures. Biochem Soc Trans. 22(3):569-74
Jung, J., Frump, D., Su, J., Wang, W., Mozaffar, T., Gupta, R. (2015). Desert hedgehog is a mediator of demyelination in compression neuropathies. Exp Neurol. 271:84-94.
Kazanskaya, O., Glinka, A., del Barco Barrantes, I., Stannek, P., Niehrs, C., Wu, W. (2004). R-Spondin2 is a secreted activator ofWnt/b-catenin signaling and is required for Xenopus myogenesis. Dev. Cell. 7: 525–534
Keeshan, K. et al. (2006). Tribbles homolog 2 inactivates C/EBPalpha and causes acute myelogenous leukemia. Cancer Cell. 10(5):401-11
Kessler, T., Hache, H., Wierling, C. (2013). Integrative analysis of cancer-related signaling pathways. Front Physiol. 4:124
Kraus, C., Liehr, T., Hülsken, J., Behrens, J., Birchmeier, W., Grzeschik, K. H., Ballhausen, W.
G. (1994). Localization of the human beta-catenin gene (CTNNB1) to 3p21: a region implicated in tumor development. Genomics. 23 (1): 272–4
Krebs, L. T. et al. (2000). Notch signaling is essential for vascular morphogenesis in mice.
Genes Dev. 1; 14(11):1343-52
Kume, T. (2009). Novel insights into the differential functions of Notch ligands in vascular formation. J Angiogenes Res. 1: 8. doi: 10.1186/2040-2384-1-8
Levi, J. U., Zeppa, R. (1971). Source of the Humoral Factor That Initiates Hepatic Regeneration. Annals of Surgery. 174:3. 364-370
Levine, A. J. (1997). p53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell 88, 323–331 Liu, J., Zhang, C., Hu, W., Feng, Z. (2015). Tumor suppressor p53 and its mutants in cancer metabolism. Cancer Lett. 28;356(2 Pt A):197-203
Liu, Z. J. et al. (2003). Regulation of Notch1 and Dll4 by vascular endothelial growth factor in arterial endothelial cells: implications for modulating arteriogenesis and angiogenesis. Mol Cell Biol. 23(1):14-25
Liu, W. et al. (2000). Mutations in AXIN2 cause colorectal cancer with defective mismatch repair by activating beta-catenin/TCF signalling. Nat Genet. 26(2):146-7
Llovet, J. M. et al. (2016). Hepatocellular carcinoma. Nat Rev Dis Primers. 14;2:16018.
47
Mescher, A.L. 2009. Junqueira's Basic Histology: Text and Atlas, 12th ed. McGraw-Hill Medical. USA. Lk. 289
Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. (1997) Liver regeneration. Science. 4; 276 (5309): 60-6
Miyajima, A., Tanaka, M., Itoh, T. (2014). Stem/progenitor cells in liver development, homeostasis, regeneration, and reprogramming. Cell Stem Cell. 14(5):561–574
Moeini, A.,Helena Cornellà, H., Villanuevaa, A. (2012). Emerging Signaling Pathways in Hepatocellular Carcinoma. Liver Cancer. 1(2): 83–93
Morin, P. J. (1999). Beta-catenin signaling and cancer. BioEssays 21 (12): 1021–30
Motokura, T. et al. (1991). A novel cyclin encoded by a bcl1-linked candidate oncogene.
Nature. 350(6318):512-5
Mu, X. et al. (2015). Hepatocellular carcinoma originates from hepatocytes and not from the progenitor/biliary compartment. J Clin Invest. doi:10.1172/JCI77995.
Murthy, S. S., Tosolini, A., Taguchi, T., Testa, J.R. (2000). Mapping of AKT3, encoding a member of the Akt/protein kinase B family, to human and rodent chromosomes by fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet 88:38–40
Mäemets-Allas, K., Belitškin, D., Jaks, V. (2016). The inhibition of Akt-Pdpk1 interaction efficiently suppresses the growth of murine primary liver tumor cells. Biochem Biophys Res Commun. 20;474(1):118-25
Nakanishi, K. et al. (2005). Akt phosphorylation is a risk factor for early disease recurrence and poor prognosis in hepatocellular carcinoma. Cancer. 103(2):307-12
Nakata, S., Phillips, E., Goidts, V. (2014) Emerging role for leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptors LGR5 and LGR4 in cancer stem cells. Cancer Manag Res. 2014; 6:
171–180.
Nienstedt, W. et al. 2005. Inimese füsioloogia ja anatoomia, 2. trükk. Medicina. Tallinn. Lk-316-323
Nusse, R., Varmus, H. E. (1982). Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome. Cell. 31. 99–109
Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E. (1980). Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila. Nature 287: 795-801
48
Park, J. T. et al. (2006). Notch3 gene amplification in ovarian cancer. Cancer Res. 66(12):6312-8
Parka, D-H. et al. (2009). Diethylnitrosamine (DEN) induces irreversible hepatocellular carcinogenesis through overexpression of G1/S-phase regulatory proteins in rat. Toxicol Lett 191 (2009) 321–326
Peifer, M., Polakis, P. (2000). Wnt signaling in oncogenesis and embryogenesis-a look outside the nucleus. Science 287: 1606-1609
Peifer, M., Rauskolb, C., Williams, M., Riggleman, B., Wieschaus, E. (1991). The segment polarity gene armadillo interacts with the wingless signaling pathway in both embryonic and adult pattern formation. Development 111 (4): 1029–1043
Peters, R. L. (1976) in: Okuda, K. Peters K. L. (Eds.) Pathology of hepatocellular carcinoma. Wiley. New York. USA: 107–168
Petitjean, A. , Achatz, M. I., Borresen-Dale, A. L., Hainaut, P., Olivier, M. (2007). TP53 mutations in human cancers: functional selection and impact on cancer prognosis and outcomes.
Oncogene 26. 2157–2165
Pocock, G., Richards, C. D., Richards, D. A. 2012. Human physiology, 4th ed. Oxford University Press. United Kingdom. Lk. 627-640
Pommier, Y. et al. (2004). Apoptosis defects and chemotherapy resistance: molecular interaction maps and networks. Oncogene 23(16):2934-49
Reyal, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. (2001). Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature 414. 105-111.
Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. (1993). Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell.75(7): 1401-16
Riggle, K. M., Turnham, R., Scott, J. D., Yeung R. S., Riehle, K. J. (2016). Fibrolamellar Hepatocellular Carcinoma: Mechanistic Distinction From Adult Hepatocellular Carcinoma.
Pediatr Blood Cancer. doi: 10.1002/ pbc. 25970
Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. (2008). Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 9, 402–412
Ruppert, J. M., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. (1991). The zinc finger protein GLI transforms primary cells in cooperation with adenovirus E1A. Mol. Cell. Biol. 11, 1724-1728
49
Schoenberg Fejzo, M., Slamon, DJ. (2001). Frozen tumor tissue microarray technology for analysis of tumor RNA, DNA, and proteins. Am J Pathol 159 (5): 1645–50
Sherman, M. (2010). Hepatocellular carcinoma: epidemiology, surveillance, and diagnosis.
Semin Liver Dis. 30(1):3-16.
Sirica, A. E. (2005). Cholangiocarcinoma: molecular targeting strategies for chemoprevention and therapy. Hepatology. 41(1):5-15
Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. (1988). Purffication and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells. Science. 241, 58–62
Staal, S. P. (1987). Molecular cloning of the akt oncogene and its human homologues AKT1 and AKT2: amplification of AKT1 in a primary human gastric adenocarcinoma. Proc Natl Acad Sci. 84:5034–7
Stäubli, W., Hess, R. ja Weibel, E. R. (1969). Correlated morphometric and biochemical studies on the liver cell. II. Effects of phenobarbital on rat hepatocytes. J Cell Biol. 42: 92-112
Surget, S., Khoury, M. P., Bourdon, J. C. (2013). Uncovering the role of p53 splice variants in human malignancy: a clinical perspective. Onco Targets Ther. 7:57-68
Taipale, J.,. Cooper, M. K., Maiti, T., Beachy, P. A. (2002). Patched acts catalytically to suppress the activity of Smoothened. Nature. 418(6900):892-7
Taniguchi, C. M. et al. (2010). The phosphoinositide 3-kinase regulatory subunit p85alpha can exert tumor suppressor properties through negative regulation of growth factor signaling.
Cancer Res. 1;70(13):5305-15
Terraz, S., Becker, C. (2005). Cholangiocellular Carcinoma. Focal Liver Lesions Medical Radiology. Part 5. 219-238
Valenti, L. et al. (2013). Hepatic Notch Signaling Correlates With Insulin Resistance and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Diabetes. 2013 Dec; 62(12): 4052–4062
Van Camp, J. K., Beckers, S., Zegers D., Van Hul, W. (2013). Wnt Signaling and the Control of Human Stem Cell Fate. Stem Cell Rev. 10: 207-229
Varjosalo, M., Taipale, J. (2008). Hedgehog: functions and mechanisms. Genes Dev. 22: 2454-2472
50
Verna, L., Whysner, J., Williams, G. M. (1996). N-Nitrosodiethylamine Mechanistic Data and Risk Assessment: Bioactivation, DNA-Adduct Formation, Mutagenicity, and Tumor Initiation.
Pharmacol. Ther. 71, 57–81
Villanueva, A. et al. (2007). Genomics and signaling pathways in hepatocellular carcinoma.
Semin Liver Dis 27(1):55-76
Villanueva, A. et al. (2012). Notch Signaling is Activated in Human Hepatocellular Carcinoma and Induces Tumor Formation in Mice. Gastroenterology. 143(6): 1660–1669
Wodarz, A., Nusse, R. (1998). Mechanisms of Wnt signaling in development. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 59–88
Vogelstein, B., Kinzler, K. W. (1992). p53 function and dysfunction. Cell. 70(4):523-6
Woodward, W. A. et al. (2007). WNT/beta-catenin mediates radiation resistance of mouse mammary progenitor cells. Proc Natl Acad Sci. 104(2):618-23
Xu, H. S., Rosenlof, L. K., Jones, R.S. (1993). Bile secretion and liver regeneration in partially hepatectomized rats. Annals of surgery. 218: 176-82
Xu, L. et al. (2015). Genomic analysis of fibrolamellar hepatocellular carcinoma. Hum Mol Genet. 24:50–63
Xu, X. et al. (2006). Induction of intrahepatic cholangiocellular carcinoma by liver-specific disruption of Smad4 and Pten in mice. J Clin Invest. 116(7):1843–1852. doi:10.1172/JCI27282.
Yonish-Rouach, E. et al. (1991). Wild-type p53 induces apoptosis of myeloid leukaemic cells that is inhibited by interleukin-6. Nature 352, 345–347
51 LISAD
Lisa 1. Loomkatsete luba
52
53
54
Joonis 1. mRNA hulk, mis on normaliseeritud referentsgeeni Gapdh suhtes. X-teljel on tootud uuritud ajapunkt ja Y-teljel normaliseerimiseks kasutatud referentstüvi. Graafikutel on
Joonis 1. mRNA hulk, mis on normaliseeritud referentsgeeni Gapdh suhtes. X-teljel on tootud uuritud ajapunkt ja Y-teljel normaliseerimiseks kasutatud referentstüvi. Graafikutel on