Numerous aspects of the electronic as well as the spatial structure of the active site intermediates have been clarified in this thesis. However, many uncertainties remain to be resolved. Much hints to the presence of an equatorial µ-oxo species in the Ni-A state of the D. vulgaris Miyazaki F hydrogenase.
Further investigations would help to elucidate whether this ligand is protonated or not. The latter has been proposed by DFT calculations [81]. 17O ENDOR studies at Q-band frequencies would not only corroborate the nature of the small equatorial bridging ligand present in the Ni-A and Ni-B state but would also provide further valuable data about the electronic structure of these states. HYSCORE experiments, like exerted for the Ni-B state, would help to determine the step of protonation of this ligand. 15N labeling would reveal whether there are further hydrons present in the states investigated in this work. Successful 61Ni ENDOR studies at Q-band frequencies or single crystal EPR studies on the isotope labelled enzyme would allow to derive the full 61Ni hyperfine tensors of all paramagnetic intermediates of the hydrogenase.
The heterolytic hydrogen cleavage necessitates the presence of a nearby base [191, 192], in the [NiFe]-hydrogenases a thiolate or selenothiolate could take over this role [156]. Thus, the question arises whether there is a second exchangeable proton present at the active site in the Ni-C state. In the [NiFeSe]-hydrogenase from D. baculatum, the residue corresponding to Cys546 is replaced by a se-lenocysteine. This terminal cysteine (SeCys487L or Cys546) displays significantly larger temperature factors than the rest of the active site [23, 27, 36]. It was proposed that this residue is involved in trans-ferring the proton resulting from the heterolytic cleavage towards the molecular surface. Consequently, this residue would play the role of a base in the first step of the catalytic process [36]. However, a solvent exchangeable 1H/2H coupling that would come into question for such a proton has only been observed in the case of the D. gigas hydrogenase [37]. In the regulatory hydrogenase from R. eu-tropha no second H/D exchangeable proton was detected and the spectroscopically accessible data for the standard hydrogenase under investigation prevented a justified statement. Thus, still there is no ex-perimental evidence where the second substrate proton is bound or whether it is already removed from the active site before the Ni-C state is regenerated.
Moreover, after stating the similarities between the regulatory and the standard hydrogenase the
132 8.3 Outlook question arises what causes the difference in their respective catalytic activities. The extent how the protein environment determines the structure of the active site and furthermore the activity of the en-zyme remains to be further evaluated in future. According to the results obtained herein substantial differences exist in the cofactor surrounding. It was shown by H/D exchange that the active site of stan-dard hydrogenases considerably interacts with His88. This residue is believed to be responsible for the proton transport to the surface of the enzyme. In regulatory hydrogenases this residue is replaced by a glutamine [7]. The hyperfine coupling with this residue could not be resolved in neither in ESEEM nor in HYSCORE spectra [130, 131]. A replacement of this residue by a histidine maintained the stability of the enzyme and yielded ESEEM spectra comparable to standard hydrogenases [130, 131]. The activ-ity of this mutant still was much lower than that of standard hydrogenases. However, solvent induced changes on this residue of the mutant have not been studied so far which would help to further clarify the role of this histidine.
DFT theory has turned out to be a valuable tool for more comprehensive understanding of the mechanism of the heterolytic splitting of molecular hydrogen and delivered proposals of the structures which constitute intermediates of the catalytic cycle. The results of this study strongly suggest that for the development of a more detailed mechanism also the immediate protein surrounding of the active site should be included in the calculations not only for the oxidized [142] but also for the reduced states.
Much effort has been spent in generating site-directed mutants of hydrogenases of the genus Desul-fovibrio. The expression of one specific hydrogenase is only possible in cells of the corresponding bacterial strain, due to the fact that there are several proteins involved in the maturation of the hydroge-nase (up to 12 in E. coli, but the function of only four of them is clarified [202]) which are typal, i.e. the maturation proteins of E. coli can not process a hydrogenase precursor of D. vulgaris Miyazaki F. This means that a heterologous expression of hydrogenase is excluded. Up to now site-directed mutagenesis succeeded only in the case of D. fructosovorans hydrogenase [28, 64]. Site directed mutagenesis on the standard hydrogenase which would replace the His88 residue by e g a glutamine could provide valuable information about the impact of this residue to the proton transport from the active site. The question whether Arg479 plays a role as a trap for the light driven cleavage of the substrate from the active site could be elucidated by a corresponding replacement.8.3a A cluster conversion like it has been achieved for this hydrogenase would allow to obtain the reduced paramagnetic states without splitting of the EPR lines as the midpoint potential of the conversed iron-sulfur cluster would be decreased [28].
More thorough spectroscopic investigations of the active site without disturbing contributions by these clusters would be facilitated. This would disclose further details of the structure of the active site cluster in the Ni-C and Ni-L state. Furthermore, the specific roles of highly conserved residues in the vicinity of the active site, of the assumed proton or of gas channels could be elucidated. Moreover, additional
8.3aIt has to mentioned that this residue also stabilizes the coordination of the iron of the [NiFe]-site by the diatomics through hydrogen bonding [23–25, 28, 29]. Possibly, the [NiFe] core of the enzyme might loose stability upon a replacement. Possible candidates could be either Glu, His or Lys.
Conclusion and Outlook 133 details about the yet not understood electron transfer from the locus of substrate conversion to the physiological redox partner would be provided.
134 8.3 Outlook
135
Chapter 9
Zusammenfassung und Ausblick
In der vorliegenden Arbeit wurden [NiFe]-Hydrogenasen mit den Methoden der magnetischen Re-sonanzspektroskopie (EPR, ENDOR, ESEEM und HYSCORE) untersucht. Ziel der Arbeit war die Charakterisierung der elektronischen und geometrischen Struktur des aktiven Zentrums und dessen Wechselwirkung mit der Proteinumgebung.
[NiFe]-Hydrogenasen sind Metalloenzyme, die die reversible, heterolytische Wasserstoffspaltung katalysieren. Das aktive Zentrum ist ein Nickel-Eisen-Komplex, der in der grossen Untereinheit des heterodimeren Enzyms lokalisiert ist. Dieser Metallcluster ist durch vier Cysteinreste an die Protein-matrix gebunden. Nickel ist durch die vier Cysteinate koordiniert, zwei davon verbr¨uckend zum Eisen.
Drei anorganische Liganden sind terminal an das Eisen gebunden. Ausserdem ist noch ein weiterer Br¨uckenligand X vorhanden, der bisher noch nicht eindeutig experimentell identifiziert werden konn-te. W¨ahrend des Katalysezyklusses durchlaufen [NiFe]-Hydrogenasen verschiedene paramagnetische Zust¨ande, die sich bez¨uglich ihrer strukturellen und elektronischen Eigenschaften unterscheiden. Diese werden mit Ni-A, Ni-B und Ni-C bezeichnet. Durch Beleuchtung des Ni-C-Zustandes l¨asst sich ein weiterer paramagnetischer Zustand, Ni-L genannt, erhalten.
Die Orientierung des g-Tensors und seine Hauptwerte des Ni-C und Ni-L Zustandes wurden im Rahmen dieser Arbeit bestimmt. Sie stellen ein Maß f¨ur die elektronische Struktur des aktiven Zentrums dar. Die Kenntnis dieser Parameter ist Voraussetzung f¨ur die Analyse weiterer EPR-spektroskopischer Studien. Die Wechselwirkung des ungepaarten Elektronenspins mit dem 61Ni-isotopenmarkierten ak-tiven Zentrum wurde f¨ur alle genannten Zust¨ande analysiert. Schliesslich wurde die Wechselwirkung der ungepaarten Spins am [NiFe]-Zentrum mit paramagnetischen Kernen in dessen Umgebung, wie zum Beispiel mit 12H,14N und mit17O, untersucht. Auf diese Weise konnte ein pr¨aziseres Bild der verschiedenen paramagnetischen Zust¨ande der [NiFe]-Hydrogenasen gewonnen werden. Die Ergeb-nisse dieser Arbeit werden nun im Folgenden zusammengefasst.
Die g-Tensororientierung im Ni-C und Ni-L Zustand. Der Ni-C und der Ni-L Zustand wurde in Einkristallen der D. vulgaris Miyazaki F Hydrogenase pr¨apariert. Durch Analyse der
orientierungs-136
abh¨angigen Einkristall-EPR-Spektren wurden die Hauptwerte und die Orientierung der g-Tensoren im Kristallachsensystem f¨ur die beiden Zust¨ande bestimmt. Die g-Tensororientierungen konnten durch Vergleich mit der R¨ontgenstruktur des reduzierten Enzyms in Verbindung mit der atomaren Struktur gebracht werden. Obwohl die g-Tensorhauptwerte der Ni-C und Ni-L Zust¨ande sich sehr unterschei-den, sind die g-Tensororientierungen sich sehr ¨ahnlich. Sie haben die gleiche Vorzugsrichtung wie der Ni-A und Ni-B Zustand bez¨uglich der g3 Achse, g1 und g2 hingegen sind vertauscht [79, 85]. Die experimentell bestimmten g-Tensorachsen wurden mit denen verglichen, die mit Methoden der Dichte-funktionaltheorie (DFT) berechnet wurden [124]. Der f¨ur Ni-C berechnete g-Tensor stimmt gut mit dem experimentellen in Orientierung und in der Gr¨osse der Hauptwerte ¨uberein, wenn ein formaler Ni(III) Oxidationszustand mit einem Hydrid (H ) als verbr¨uckendem Liganden den Berechnungen zu-grunde gelegt wird. Zufriedenstellende ¨Ubereinstimmung erh¨alt man f¨ur den Ni-L Zustand, wenn man annimmt, dass ein Proton durch Beleuchtung abgespalten wurde, also ein formaler Ni(I) Oxidationszu-stand vorliegt.
Bestimmung der 61Ni Hyperfeinwechselwirkungen. Mit Hilfe von EPR Studien an der 61 Ni-iso-topenmarkierter Hydrogenase erlaubten es, die Hauptwerte der 61Ni-Hyperfeintensoren f¨ur den Ni-A, B, C und den L Zustand zu bestimmen. Die gr¨osste Aufspaltung wurde f¨ur die A, Ni-B und Ni-C Zust¨ande an der g3 Komponente des EPR Spektrums beobachtet und hat f¨ur alle drei Zust¨ande die gleiche Gr¨osse. Im Gegensatz dazu zeigt Ni-L die gr¨osste Aufspaltung an der g1 Kom-ponente. Unter der Annahme, dass f¨ur die Ni-A, Ni-B und Ni-C Zust¨ande die relativen Vorzeichen der Hyperfeinaufspaltung alle gleich sind und, dass im Ni-L Zustand die gr¨osste Hyperfeinkopplung ein anderes Vorzeichen hat, konnten die isotropen und anisotropen Anteile der Kopplungen bestimmt werden. In den Ni-A, Ni-B und Ni-C Zust¨anden ¨andern sich weder der isotrope noch der anisotrope Anteil der Hyperfeinkopplung. Der Ni-L Zustand hat eine isotrope Hyperfeinkopplung von fast Null.
Die absoluten Werte der Hyperfeinkopplungskonstanten sind klein im Vergleich mit den Werten der isotropen Wechselwirkung f¨ur eine Spindichte von eins (etwa 1 %) und im Vergleich mit denen der anisotropen Hyperfeinparameter f¨ur d-Orbitale. Aus diesen Werten wurde eine Absch¨atzung f¨ur die jeweiligen Spindichten am Nickel erhalten. Nach diesen Sch¨atzungen ist ein betr¨achtlicher Teil der Spindichte in allen vier Zust¨anden auf die Schwefelatome der Cysteine verteilt. Ausserdem ist die d-Orbitalspindichte im Ni-L Zustand ist im Vergleich zu den anderen Zust¨anden erh¨oht.
Bestimmung der12H,14N und17O Hyperfeinwechselwirkungen. ENDOR und Puls-EPR erlauben es, ein umfassendes Bild ¨uber die Umgebung des Elektronenspins zu erhalten. Folgende Zust¨ande der [NiFe]-Hydrogenasen wurden detailliert untersucht: Der Ni-B, Ni-C und der Ni-L Zustand.
Es wurden12H-HYSCORE Spektren von H/D ausgetauschten Proben aufgenommen. Durch Ana-lyse dieser Spektren konnte der vollst¨andige Hyperfeintensor eines H/D austauschbaren Protons be-stimmt werden. Diese Hyperfeinkopplung wurde einem Proton am ¨aquatorialen Br¨uckenliganden
zuge-Zusammenfassung und Ausblick 137 ordnet. Aufgrund von Linienbreiteneffekten, die bei einer 17O-Markierung auftraten, wurde geschlos-sen, dass es sich in der D. vulgaris Miyazaki F Hydrogenase bei diesem Br¨uckenliganden eher um ein Hydroxid- denn um einen Sulfhydrylmolek¨ul handelt, obwohl letzteres aufgrund von R¨ontgenstruktur-daten und massenspektroskopischen Untersuchungen bisher favorisiert wurde [23, 151]. Ausserdem wurden die vollst¨andigen Hyperfein- und Quadrupolkopplungstensoren f¨ur eine Stickstoffkopplung f¨ur das Enzym in H2O und D2O im Ni-A und Ni-B Zustand bestimmt. Diese Stickstoffkopplung wurde dem N(ε) von His88, einem Liganden in direkter N¨ahe des aktiven Zentrums, zugeordnet. Die Daten deuten auf eine Abstandsvergr¨osserung des N(ε) zum Nickelzentrum nach dem H/D-Austausch hin.
Durch12H-HYSCORE spektroskopische Untersuchungen konnte der vollst¨andige Hyperfeintensor eines H/D austauschbaren Hydrides, mit den Hauptwerten A 11 1 20 8 20 2 MHz, im Ni-C Zustand ermittelt werden. Die Daten zeigen, dass dieses Hydrid, das Produkt der Wasserstoffspaltung, in der Br¨ucke gebunden ist. Der Vergleich des in dieser Arbeit bestimmten Tensors mit fr¨uheren Daten, die durch die Simulation von EPR Spektren der D. gigas Hydrogenase erhalten wurden [37], zeigt, dass die Absolutbetr¨age der Tensorhauptwerte gut ¨ubereinstimmen. Mit den hier gewonnenen Daten wird jedoch eine andere Vorzeichenzuordnung vorgeschlagen, n¨amlich A 15 20 25 MHz.
Die HYSCORE Spektren waren noch von weiteren Kopplungen mit verschiedenen Stickstoffkernen
¨uberlagert. Diese wurden dem N(ε) von His88 und Stickstoffkopplungen der ebenfalls reduzierten Eisenschwefelcluster zugeordnet. ENDOR Spektren, die vom teilweise unsplit Ni-C Zustand der D.
vulgaris Miyazaki F Hydrogenase aufgezeichnet wurden, wurden analysiert und es konnten vier Hy-perfeintensoren bestimmt werden. Diese wurdenβ-CH2Protonen der ligandierenden Cysteinreste zu-geordnet. Die gr¨osseren Hyperfeinkopplungen wurden mit zwei Protonen am verbr¨uckenden Cys549 gefunden (aiso= 12.4 MHz and adip= 2.2 MHz, aiso= 12.2 MHz and adip= 1.1 MHz), kleinere am termi-nalen Cys546 (aiso= 9.0 MHz und adip= 1.7 MHz, aiso= 5.6 MHz und adip= 1.7 MHz). Die Hauptwerte der Hyperfeinkopplungen sind in ihrer Gr¨osse vergleichbar mit denen, die f¨ur den Ni-B Zustand der D.
vulgaris Miyazaki F und der A. vinosum Hydrogenase bestimmt wurden. Die Resultate aus ENDOR und HYSCORE spektroskopischen Untersuchungen wurden mit denen an einem verwandten System, der regulatorischen Hydrogenase (RH) aus R. eutropha verglichen [185]. Dieses Enzym ist den Stan-dard [NiFe]-Hydrogenasen sehr ¨ahnlich, obwohl es praktisch keine katalytische Aktivit¨at zeigt. Auch dort wurde ein H/D austauschbares Hydrid gefunden. Dessen Hyperfeintensor stimmt bez¨uglich der Hauptwerte gut mit dem aus dieser Arbeit ¨uberein. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Annahme von Brecht et. al, dass die g-Tensororientierung des Ni-Zustandes der RH dem, der f¨ur die D. vulgaris Miyazaki F Hydrogenase bestimmt wurde, sehr ¨ahnlich ist, best¨atigt werden. Die Hyperfeintensoren der β-CH2 Protonen der Cysteine der jeweiligen Enzyme sind damit ebenfalls in ihrer Orientierung einander sehr ¨ahnlich, die isotropen Hyperfeinkopplungen sind jedoch um etwa 5 MHz gr¨osser, als f¨ur die D. vulgaris Miyazaki F Hydrogenase [185].
Es konnte mit Hilfe von HYSCORE spektroskopischen Untersuchungen gezeigt werden, dass das H/D austauschbare Hydrid in der D. vulgaris Miyazaki F Hydrogenase durch Beleuchtung
abgespal-138
ten werden kann. Die stark anisotrope Deuteriumkopplung verschwindet v¨ollig aus den HYSCORE Spektren, diese sind im Ni-L Zustand von den schon f¨ur Ni-C beschriebenen Stickstoffkopplungen dominiert. ENDOR Studien erlaubten es, die vollst¨andigen Hyperfeintensoren der β-CH2 Protonen der ligandierenden Cysteine der D. vulgaris Miyazaki F Hydrogenase im Ni-L Zustand zu bestimmen.
W¨ahrend die anistrope Hyperfeinkopplungskonstanten sich beim ¨Ubergang von Ni-C nach Ni-L kaum
¨andern, verringerte sich f¨ur die Protonen am Cys549 die Gr¨osse der isotropen Hyperfeinkopplungen drastisch, um etwa 3-4 MHz. Dies wurde dahingehend interpretiert, dass sich die Spindichte in diesem Zustand von den Liganden mehr auf den Nickel verlagert hat. Im Rahmen dieser Arbeit wurden ausser-dem die ENDOR Spektren der regulatorischen Hydrogenase aus R. eutropha im Ni-L und Ni-LA Zus-tand im Detail analysiert. Ni-LAist dabei das Intermediat des ¨Ubergangs vom Ni-L zum Ni-C Zustand.
F¨ur beide Zust¨ande wurden die Hauptwerte und die Orientierung von jeweils drei Hyperfeintensoren relativ zum g-Tensor bestimmt. Unter der Annahme, dass sich die g-Tensororientierungen in den Ni-L Zust¨anden der R. eutropha Hydrogenase und der der D. vulgaris Miyazaki F Hydrogenase ¨ahnlich sind, wurden diese Tensoren im Ni-L Zustand zu zweiβ-CH2Protonen am verbr¨uckenden Cystein und ein Tensor zu dem am terminalen Cystein zugeordnet. Der Ni-C und der Ni-L Zustand der R. eutropha Hydrogenase zeigen wie auch die D. vulgaris Miyazaki F Hydrogenase ¨ahnliche Hyperfeintensororien-tierungen. Im Ni-LAZustand hingegen konnte unter dieser Annahme eine davon abweichende Zurord-nung gemacht werden: zwei Tensoren wurdenβ-CH2Protonen an zwei verschiedenen verbr¨uckenden Cysteinen zugeschrieben und eine demβ-CH2Proton eines terminalen Cysteins. Als Erkl¨arung daf¨ur wurde eine Drehung des g-Tensors in diesem Zustand um etwa 30-50 , im Vergleich zum Ni-L Zustand der D. vulgaris Miyazaki F Hydrogenase, vorgeschlagen.
Ausblick. Zahlreiche Aspekte der elektronischen, wie auch der geometrischen Struktur der Interme-diate des aktiven Zentrums von [NiFe]-Hydrogenasen wurden im Rahmen dieser Arbeit aufgekl¨art.
Dennoch bleiben noch viele Fragen offen. Es gibt Hinweise auf einen µ-Hydroxo Liganden im Ni-B Zustand, damit also auch auf eine verbr¨uckende Sauerstoffspezies im Ni-A Zustand in der D. vul-garis Miyazaki F Hydrogenase. 17O-ENDOR Untersuchungen (Q-Band) w¨urden nicht nur die chemis-che Natur des Br¨uckenliganden eindeutig nachweisen, sondern auch noch zus¨atzlichemis-che Daten ¨uber die elektronische Struktur dieser Zust¨ande liefern. HYSCORE Experimente am reinen Ni-A Zustand und deren Analyse w¨urden den Protonierungsgrad des Br¨uckenliganden im Ni-A Zustand aufkl¨aren.
15N-Isotopenmarkierung w¨urde bei der Identifizierung weiterer, kleinerer H/D austauschbarer Kop-plungen am aktiven Zentrum helfen. 61Ni-ENDOR Untersuchungen (Q-Band) oder Einkristall-EPR-Untersuchungen an61Ni-isotopenmarkierten Proben w¨urden schliesslich die vollst¨andigen Hyperfein-tensoren f¨ur alle Intermediate der [NiFe]-Hydrogenase liefern.
Die Dichtefunktionaltheorie hat Vorschl¨age f¨ur die Stukturen der Intermediate des Katalysezyklus’
geliefert und sich damit als wertvolles Werkzeug f¨ur ein tiefergreifendes Verst¨andnis der heterolytischen Wasserstoffspaltung erwiesen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen jedoch, dass f¨ur genauere
Berech-Zusammenfassung und Ausblick 139 nungen zus¨atzlich auch noch die direkte Proteinumgebung des aktiven Zentrums in Zukunft mit be-r¨ucksichtigt werden m¨ussen und das nicht nur f¨ur die oxidierten [142], sondern auch f¨ur die reduzierten Zust¨ande.
Sobald ein effizientes Mutagenesesystem f¨ur die D. vulgaris Miyazaki F Hydrogenase zug¨anglich ist, bieten sich gute Aussichten f¨ur Studien zur Aufkl¨arung weiterer Details des Reaktionsmechanis-mus’. Einerseits w¨are es unter Umst¨anden m¨oglich, spektroskopisch leichter zug¨angliche Mutanten zu erzeugen, als den Wildtypen, der im reduzierten Zustand spingekoppelte Eisenschwefelcluster aufweist.
Ausserdem k¨onnten die Funktionen der in den verschiedenen Sequenzen konservierten Aminos¨auren in der N¨ahe des aktiven Zentrums, zum Beispiel auch in der N¨ahe der Protonen- oder Gaskan¨ale aufgekl¨art werden. Dar¨uberhinaus w¨urde sich auch die M¨oglichkeit bieten, durch gezielten Aminos¨aureaustausch in der Umgebung der Eisenschwefelclusters Details ¨uber den bisher noch nicht verstandenen Elektro-nentransfer vom Ort der Substratspaltung, bis hin zum physiologischen Redoxpartner aufzukl¨aren.
140
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