3. Methoden zur Analyse physikochemischer, chemischer und mikro- mikro-biologischer Parameter
3.1. Aufarbeitung der Sedimentkerne
3.2.3. organischer Kohlenstoff und Stickstoff
Konzentration und Zusammensetzung des organischen Materials bestimmen mikrobielle Substratumsätze in Sedimenten. Die Konzen-trationen an organischem Kohlenstoff und Stickstoff in den Sedi-mentproben wurden mit einem Perkin Elmer CHN-Analyzer (240 C) analysiert. Getrocknete Proben (48 h, 60 °C) wurden in Silber-schiffchen eingewogen. Für sandige Sedimente mit einem relativ geringen Gehalt an organischer Substanz wurden Einwaagen im Bereich von 100 mg Trockengewicht benötigt, für schlickige Sedi-mente dagegen waren Einwaagen von etwa 50 mg Trockengewicht
ausreichend. Für Oberflächenhorizonte wurden 3 Parallelproben eingewogen, für tiefere Horizonte 2 Proben. Die eingewogenen Proben wurden in Teflongestellen in einen Exsikkator gestellt und 48 stunden mit konzentrierter HCl bedampft, um Karbonate als co2 auszutreiben. Nach 2 Tagen wurden die behandelten Proben nochmals mit 1-2 Tropfen konzentrierter HCl beträufelt, um eventuell vorhandene Karbonatreste vollständig zu entfernen. Da die
Behand-lung der Proben mit konzentrierter HCl erfolgte, ist eine teil-weise Decarboxylierung des organischen Materials nicht auszu-schließen (Folge: erniedrigte Corg Werte). Nach der Säurebehand-lung wurden die Proben erneut bei 60 °C getrocknet und bis zum Zeitpunkt der Analyse im Exsikkator aufbewahrt.
Vor und nach einer jeden Meßserie wurden Eichungen mit Acet-anilid (71.09% c, 10.36% N) durchgeführt. Die mit der Eichsub-stanz Acetanilid durchgeführten Kalibrierungskurven verliefen für Kohlenstoff und Stickstoff in einem Bereich von 320 bis 3555 µg c
bzw. 47 bis 518 µg N (entspricht einer Einwaage der Eichsubstanz zwischen 450 und 5000 µg) linear (Korrelationskoeffizienten und Anzahl der Meßpunkte der Eichkurven für organischen Kohlenstoff und Stickstoff: rc
=
1.000, nc=
18; rN=
1.000, nN=
20). Dieser untersuchte Konzentrationsbereich entspricht dem Meßbereich des CHN-Analyzers. Die Abweichungen zwischen den Parallelproben betrugen weniger als 5%.Bestimmung des Karbonatgehaltes. Eine angenäherte Bestimmung der Karbonatkonzentration erfolgte aus der Differenz des
Kohlen-stoffgehaltes in nicht angesäuerten und angesäuerten Proben.
Unter der Annahme, daß der weitaus größte Teil der Karbonate in den Sedimenten als caco 3 vorliegt, kann man die Konzentration des Kalziumkarbonates errechnen (VERARDO et al. 1990).
3,3, Enzymatischer Abbau von organischem Material
3,3,1, Grundlagen der Messung
In marinen Sedimenten wird partikuläres organisches Material durch intra- und extrazelluläre Enzyme abgebaut, die hochmoleku-lares Material hydrolysieren. Die niedermolekularen Bausteine werden für den Aufbau von Biomasse oder für die Respiration genutzt. Enzyme, die katabolische Stoffwechselprozesse steuern, werden teils von Bakterienzellen ausgeschieden, teils aber tragen auch Enzyme von Meio- und Makrofaunaorganismen (z.B. Verdauungs-enzyme) und durch Lyse freigesetzte Enzyme wesentlich zum Abbau von organischem Material bei (KÖSTER et al. 1991).
Die enzymatische Hydrolyse von organischem Material ist der einleitende und geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Oxidation von organischem Material. Da geeignete in-situ Meßme-thoden für die Bestimmung enzymatischer Abbauaktivitäten in Sedimenten fehlen, werden in enzymatischen Untersuchungen zumeist farbstoffmarkierte Modellsubstrate eingesetzt. Das Prinzip der Messung beruht darauf, daß ein an das Substrat gekoppelter Farb-stoff durch enzymatische Hydrolyse freigesetzt wird. Durch die Bestimmung der Konzentration des freigesetzten Farbstoffes in Zeitreihenexperimenten können enzymatische Aktivitätsraten ermit-telt werden. Als Modellsubstrate stehen kovalent-gebundene Farb-stoffderivate oder fluoreszenzmarkierte Substrate zur Verfügung
(REICHARDT 1988 a, HOPPE 1991, MEYER-REIL 1991), deren Eignung zur Bestimmung enzymatischer Aktivitäten in Sedimenten in Vorver-suchen überprüft wurde.
Partikuläre Substrat-Farbstoffderivate (z.B. Hide Powder Azure, Amylopektin, MEYER-REIL 1984, REICHARDT 1986 a, 1988 a), die am besten die Natur von partikulärem organischen Material simulieren, eigneten sich für die Untersuchungen wenig, da keine homogene Verteilung des Substrates im Sediment erreicht werden konnte. Außerdem zeichneten sich diese Substrate durch hohe Eigenextinktionen aus, die die Messung geringer Umsatzraten
erschwerten. Längere Inkubationszeiten, die die mikrobielle Pro-liferation begünstigten, waren häufig die Regel. Die Sensitivi-tätsgrenze für die Bestimmung der Konzentration des freigesetzten Farbstoffes liegt bei einer spektralfluorometrischen Messung in einem Bereich von 10-8 Mol.
Die Verwendung fluoreszenzmarkierter gelöster Substrate für die Messung enzymatischer Aktivitäten wurde mit Substraten wie Methylcoumarinylamid (MCA)-Derivaten und Fluoresceindiacetat (FDA) überprüft. MCA-Aminosäurederivate sind Substrate, die sub-stratspezifisch von Peptidasen gespalten werden. Fluoresceindi-acetat wird dagegen unspezifisch von Esterasen (Peptidasen, Lipa-sen, GlucosidaLipa-sen, Phosphatasen) in Acetat und Fluorescein ge-spalten (Abb. 5; MEDZON and BRADY 1969, SCHNÜRER and ROSSWALL 1982). Da die Konzentration des freigesetzten Farbstoffes fluoro-metrisch (Sensitivitätsgrenze: 10-13 M) bestimmt werden kann, können im Vergleich zur photometrischen Messung um mehrere Größenordnungen niedrigere Konzentrationsbereiche erfaßt werden.
HO OH
Esterasen
Fluoresceindiacetat Fluorescein Acetat
Abb. 5: Enzymatische Spaltung von Fluoresceindiacetat in Acetat und Fluorescein (verändert nach MEDZON and BRADY 1969).
Bei der Verwendung von künstlichen Substraten (im Sättigungsbe-reich) ist nur eine Aussage über ein enzymatisches Aktivitätspo-tential zulässig. Das hydrolytische PoAktivitätspo-tential wird vom Pool der natürlichen Enzyme bestimmt, deren Konzentration und Zusammenset-zung wiederum von Spektrum und Menge der natürlichen Substrate gesteuert wird (MEYER-REIL 1991). Insofern spiegeln Änderungen in den enzymatischen Abbauaktivitäten die vorausgegangene Nährstoff-situation wider.
Das enzymatische Aktivitätspotential wurde in suspendierten Sedimentproben bestimmt, da die von MEYER-REIL (1986) beschriebe-ne Injektionstechnik wegen der unzureichenden Verteilung des injizierten Substrates nicht für tonig-siltige Tiefseesedimente eingesetzt werden konnte. Eine Übertragung der Aussage auf natür-liche enzymatische Aktivitäten in ungestörten Sedimenten ist somit begrenzt.
Da in marinen Sedimenten der enzymatische Abbau von partikulä-rem organischen Material durch eine Vielzahl von Enzymen einge-leitet wird, wurde als ein relativ unspezifisches Modellsubstrat Fluoresceindiacetat ausgewählt. Der Einsatz dieses Substrates versprach eine ausreichende Sensitivität, um auch noch sehr geringe enzymatische Aktivitäten zu messen, wie sie in pelagi-schen Sedimenten der Tiefsee zu erwarten sind.