3. ERGEBNISSE
3.3. Untersuchung der bakteriellen Adhäsion an Lipide mittels HPTLC
3.3.1. Optimierung der Methode zur Untersuchung der bakteriellen
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Die hier nicht dargestellten Gangliosidstandards hatten sich nach der Entwicklung der HPTLC-Platte nur wenig von der Auftrageposition wegbewegt und zeigten somit keine Übereinstimmung mit den Banden des Lipidextraktes aus Corneozyten. Die Banden in Nähe der Startlinie des Keratinozyten-Lipidextraktes waren nur schwach nach der CuSO4-Detektion zu sehen und konnten nicht identifiziert werden.
3.3. Untersuchung der bakteriellen Adhäsion an Lipide
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spezifische Bindungsstellen blockiert, bevor die HPTLC-Platten mit Bakterienlösung überschichtet wurden.
Es war unwahrscheinlich, dass die BSA-Blockierung die Anlagerung von C. group G (86) an die weniger polaren und unpolaren Lipide verhindert hat. Statt dessen wurde vermutet, dass durch die Überschichtung mit Plexigum Bindungsstellen an den Lipi-den blockiert wurLipi-den. In der Schicht aus Plexigum sollten sich die amphoteren Gly-kolipide ähnlich wie in der Zellmembran ausrichten, so dass hydrophile Glyko-Epitope an der Oberfläche der Matrix exponiert werden (KARLSSON et al., 1987). Um zu untersuchen, ob weniger polare bzw. unpolare Lipide, die keine hydrophilen Gly-ko-Epitope besitzen, durch Plexigum abgedeckt und so für Bakterien unzugänglich gemacht wurden, wurde Plexigum unterschiedlich lange in verschiedenen Konzent-rationen eingesetzt (Abb. 25 und Abb. 26). Es wurden vier Lipide getestet, die als Hautlipide bekannt sind.
Abb. 25: Einfluss der Plexigum-Konzentration auf die Bindung von C. group G (86) an ausgewählte Lipide bei einer Eintauchzeit von 1 min.
Es wurden Standardkonzentrationen von 1 µg, 2 µg und 4 µg pro Spur von links nach rechts aufgetragen. Die Platten wurde nicht im Fließmittel entwi-ckelt, sondern direkt mit verschiedenen Konzentrationen Plexigum-Lösung BSA-Lösung und Bakterienlösung überschichtet. Die Detektion erfolgte mit UV-Licht (366 nm).
Abb. 26: Einfluss der Eintauchzeit in eine 0,5 %ige Plexigum-Lösung auf die Bindung von C. group G (86) an ausgewählte Lipide.
Durchführung wie bei Abb. 25, hier wurde jedoch die Eintauchzeit in das Ple-xigum variiert.
Cholesterol-3-sulfat Pentacosan Cholesteryl-oleat Palmitinsäure
0 % 0,05 % 0,1 % 0,25 % 0,5 %
Cholesterol-3-sulfat Pentacosan Cholesteryl-oleat Palmitinsäure
0 sec 15 sec 30 sec 45 sec 60 sec
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Die Untersuchung ergab, dass bereits eine geringe Konzentration von 0,05 % Plexi-gum die Bindung von C. group G (86) an Lipide, mit Ausnahme von Cholesterol-3-sulfat, stark behinderte. Eine verkürzte Eintauchzeit der HPTLC-Platten in die Plexi-gum-Lösung ergab eine bessere Bindung, das beste Ergebnis wurde aber ohne Ple-xigum erzielt.
Bei den untersuchten Hautlipiden unterstützte Plexigum nicht die Ausrichtung auf der Platte, sondern deckte die Lipide ab und verhinderte dadurch die Bindung von C.
group G (86). Für die weiteren Untersuchungen von Lipiden wurde kein Plexigum verwendet.
3.3.1.2. Optimierung der HPTLC-Platten und Anpassung des Fließmittels Für die Auftrennung von Hautlipiden auf Kieselgelplatten ist nach SCHÜRER et al.
(1995) bereits folgende Fließmittelkombination bekannt:
Nr. Fließmittel Zusammensetzung Laufstrecke
1 Chloroform / Methanol / H2O 95 : 15 : 5, v/v/v 1 cm 2 n-Hexan / Diethylether / Eisessig 80 : 20 : 7, v/v/v 3,5 cm
3 Petroleumbenzin 100 %ig 6 cm
Tab. 8: Fließmittelsystem zur Auftrennung von Hautlipiden nachSCHÜRER et al.
(1995)
Die Entwicklung der HPTLC-Platten erfolgt nacheinander in allen drei Fließmitteln, dazwischen werden die Platten luftgetrocknet.
Nach der Entwicklung in den drei Fließmitteln aus Tab. 8 wurde die in Abb. 27 dar-gestellte Auftrennung mit einer Kieselgel 60 HPTLC-Platte von Merck erhalten. Alle Hautlipide waren ausreichend voneinander getrennt, nur Pentacosan war in der Fließmittelfront mitgelaufen und konnte nicht eindeutig detektiert werden.
Bei den vorhergehenden Untersuchungen der Glykolipide wurden diese durch die Beschichtung mit Plexigum nicht nur ausgerichtet, gleichzeitig wurden die Kiesel-gelplatten durch die Kunststoffschicht vor wässrigen Lösungen geschützt. Die fol-genden Überschichtungen mit BSA- und Bakterien-Lösung hatten keinen zerstören-den Einfluss auf die Kieselgelschicht.
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Abb. 27: Auftrennung von Hautlipiden auf einer Kieselgelplatte mit einer Kombi-nation aus drei Fließmitteln nach SCHÜRER et al. (1995).
Die Substanzen wurden am unteren Rand der Kieselgelplatten aufgetragen und mit einer Kombination aus drei Fließmitteln für Lipide entwickelt (Tab. 8).
Die linke Platte wurde mit CuSO4-Lösung detektiert. Die rechte Platte wurde mit BSA-Lösung und Bakterienlösung überschichtet und mit UV-Licht (366 nm) detektiert. Der Overlay-Assay wurde mit C. group G (86) durchgeführt.
Überschichtungen mit BSA- und Bakterien-Lösung ohne Plexigum führten bei den meisten HPTLC-Platten zur Ablösung der Kieselgelschicht von der Glasplatte und somit zur Zerstörung des Chromatogramms. In Abb. 27 ist die Ablösung der Kiesel-gelschicht nach dem Overlay-Assay am rechten Rand der HPTLC-Platte zu erken-nen.
Als Ersatz für die Kieselgelplatten G 60 von Merck wurden die Kieselgelplatten Nano-Durasil-20 von Macherey und Nagel getestet. Diese enthalten einen zusätzlichen Binder, der das Kieselgel auf der Glasplatte fixieren soll.
Einer Überschichtung mit BSA- und Bakterien-Lösung hielten die Platten stand, zeigten aber nicht das gleiche Trennergebnis bei Lipiden wie die Platten von Merck.
Nach Einsatz des zweiten Fließmittelgemisches fluoreszierte der gesamte Bereich der Platte, der mit dem Fließmittel in Kontakt gekommen war. Eine Auswertung war nicht mehr möglich. Durch einen Austausch von n-Hexan gegen Isooctan in Kombi-nation mit einem Austausch von Wasser gegen Eisessig im ersten Fließmittelge-misch, konnte das Problem behoben werden. Damit ergab sich für die weiteren Un-tersuchungen folgendes Fließmittelsystem:
Squalen Cholesteryl-oleate
Cholesterol-3-Sulfat Triolein
Ceramid III Cerebrosid II Cholesterol/
Palmitinsäure
CuSO4-Detektion Overlay-Assay
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Nr. Fließmittel Zusammensetzung Laufstrecke
1 Chloroform / Methanol / Eisessig 95 : 15 : 5, v/v/v 1 cm 2 Isooctan / Diethylether / Eisessig 80 : 20 : 7, v/v/v 3,5 cm
3 Petroleumbenzin 100 %ig 6 cm
Tab. 9: Fließmittelsystem zur Auftrennung von Hautlipiden mit Kieselgelplatten Nano-Durasil-20 von Macherey und Nagel.
3.3.1.3. Untersuchung des Einflusses der Wachstumsphase von Bakte-rien und der Nährmedien auf den Overlay-Assay
Um zu gewährleisten, dass bei den folgenden Untersuchungen die Bedingungen für alle Versuche identisch waren, sollte der Einfluss der Wachstumszeiten und der Wachstumsmedien der Bakterien untersucht werden. Es wurde stellvertretend für alle verwendeten Bakterien C. group G (86) getestet.
Auf zwei Columbia + Tween (Co+T)-Agarplatten wurden je 10 µl einer C. group G (86) Arbeitskultur ausgestrichen und jeweils eine Platte 24 h und eine Platte 48 h im Brutschrank bei 37 °C inkubiert (Methoden 2.2.2.). Desweiteren wurde zwei Flüssig-kulturen angesetzt (siehe auch Methoden 2.2.1). Hierfür wurden je 20 ml allgemeines Corynebakterien (AC)-Medium in Schikanekolben vorgelegt und mit 10 µl C. group G (86) Arbeitskultur angeimpft. Jeweils eine Flüssigkultur wurde 24 h und eine 3,5 h bei 37 °C in einem Inkubationsschüttler bei etwa 200 Umdrehungen pro Minute (RPM) geschüttelt, um die Bakterien mit ausreichend Sauerstoff zu versorgen. Die vier An-sätze wurden zeitversetzt angeimpft, so dass alle gleichzeitig den Endpunkt der In-kubation erreichten. Die Bakterien wurden mittels Thomakammer ausgezählt und von allen vier Ansätzen die gleiche Bakterienanzahl für den Overlay Assay eingesetzt.
Als Standardsubstanzen wurden auf die HPTLC-Platten neun Hautlipide in verschie-denen Konzentrationen aufgetragen: Cholesterol, Cholesterol-3-sulfat, Cholesteryl-oleat, Palmitinsäure, Triolein, Squalen, Pentacosan, Ceramid III und Ceramid IV. Die HPTLC-Platten wurden für diese Untersuchung nicht im Fließmittel entwickelt.
Abb. 28 zeigt als Beispiel die Ergebnisse der Untersuchung der Bindungsintensität von C. group G (86), gemessen in als optische Dichte (OD), an jeweils 2 µg und 4 µg Cholesterol-3-sulfat. Die anderen Standards führten zu ähnlichen Ergebnissen.
Aus Abb. 28 wird ersichtlich, dass die optimalen Adhäsionseigenschaften bei C.
group G (86) nach 48 h auf C+T-Agarplatte und nach 24 h in AC-Flüssigmedium er-reicht waren.
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Abb. 28: Überprüfung der Bindungsaffinität von C. group G (86) an Lipide in Ab-hängigkeit von der Wachstumsphase am Beispiel von Cholesterol-3-sulfat.
2 µg und 4 µg Cholesterol-3-sulfat wurden auf eine Kieselgelplatte aufgetra-gen und mit BSA-Lösung sowie Bakterienlösung überschichtet. C. group G (86) wurde nach unterschiedlich langer Inkubationszeit auf Co+T-Agarplatten und in AC-Nährmedium eingesetzt. Die Detektion erfolgte mit UV-Licht (366 nm). Die Auswertung der fluoreszierenden Banden erfolgte mit der ONE-DscanÔ Software über die Integration der optischen Dichte [IntOD].
Durch Wachstumskurven von DERWORT (2000) ist bekannt, dass die Bakterien nach 3,5 h Anzucht im Flüssigmedium in der log-Phase sind. Nach 24 h Anzucht auf der Agarplatte sind die Bakterien wahrscheinlich nicht mehr in der log-Phase. Dennoch waren nach 24 h Anzucht auf Agarplatte die Adhäsionseigenschaften noch nicht op-timal. Desweiteren war die Aufarbeitung der Bakteriensuspension nach 3,5 h schwie-rig, da die Bakterien stark verklumpten und durch fluoreszierende Artefakte den O-verlay Assay störten.
Nach 48 h Wachstumszeit auf einer Co+T-Agarplatte bzw. 24 h im AC-Medium zeigte C. group G (86) identische und reproduzierbare Bindungsintensitäten an die Standards. Aus diesem Grund wurden die Bakterien für die weiteren Untersuchun-gen bei 37 °C ca. 45 h auf Agarplatten inkubiert.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
2 µg Cholesterol-3-sulfat 4 µg Cholesterol-3-sulfat
IntOD
Platte, 48 h Platte, 24 h Flüssigkultur, 24 h Flüssigkultur, 3,5 h
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