Optimierung der Bedingungen zum Blocken der Mikrotiterplatte

Freie Bindungsstellen auf der Mikrotiterplatte müssen durch ein geeignetes Protein als Blocksubstanz besetzt werden. Das Blockmittel durfte kein Antigen der anti-ABA-BSA-Antikörper oder des sekundären anti-ABA-BSA-Antikörpers sein. Als mögliche Blockmittel kamen Fischhautgelantine (Sigma, Steinheim, Deutschland), KLH (Keyhole limpet hemocyanin) (ICN, Aurora, USA) und Ovalbumin (ICN, Aurora, USA) in Betracht.

Die Blockmittel wurden jeweils in Hinblick auf ihre unspezifische Bindung gegenüber den ABA-BSA-Konjugaten und BSA, sowie auf ihre Antigenizität gegenüber den anti-ABA-BSA-Antikörpern und Protein A untersucht.

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

0,01 0,1 1 10

log [ABA-BSA-Konjugat] (µg/ml)

E (405 nm)

1% (w/v) Ovalbumin 0,1 mg/ml KLH

1,5 % (v/v) Fischhautgelatine

Abbildung 16: Optimierung der Wahl des Blockmittels durch ELISA.

Die Mikrotiterplatten wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen (0,016 bis 10 µg/ml) ABA-BSA-Konjugat beschichtet. Freie Bindungsstellen wurden mit verschiedenen Blockmitteln abgesättigt. Der Nachweis der ABA-BSA-Konjugate erfolgte wie im Kapitel 2.8.4 beschrieben.

Zum Blocken verwendete Proteine könnten folgende Probleme beim Nachweis des Antigens verursachen: Einerseits könnten große Proteine kleinere Antigene verdecken und dadurch ihre Detektion durch den Antikörper erschweren. Weiterhin können als Blocksubstanzen verwendete Proteine an Antigene binden und somit ebenfalls eine Detektion verhindern. Aus Abbildung 16 ist zu erkennen, daß keines der verwendeten Blocksubstanzen die Detektionsfähigkeit der ABA-BSA-Konjugate wesentlich verschlechtert.

Wechselwirkungen der Konjugate mit den verwendeten Blocksubstanzen wurden durch den in Abbildung 17 dargestellten ELISA bestimmt. Dazu wurden die Mikrotiterplatten mit

verschiedenen Blockmitteln beschichtet und mit ABA-BSA-Konjugaten inkubiert. Weiterhin wurden unspezifische Bindungen des anti-ABA-Antikörpers und von Protein A an die Blocksubstanzen untersucht. Konnte kein Substratumsatz durch die Peroxidasereaktion gemessen werden, so zeigte dies, daß auch keine unspezifische Bindungen der ABA-BSA-Konjugate, des Antikörpers und von Protein A an die Blockproteine vorlagen.

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3

Ov KLH FG Ov KLH FG Ov KLH FG Ov KLH FG

E (405)

ABA-BSA BSA anti-ABA-AK Protein A

Abbildung 17: Untersuchung von unspezifischen Bindungen zwischen ABA-BSA-Konjugaten, BSA, anti-ABA-Antikörper und Protein A an Ovalbumin (Ov), KLH und Fischhautgelatine (FG).

Die Mikrotiterplatten wurden mit jeweils 1 % Ovalbumin, 0,1 mg/ml KLH oder 1,5 % Fischhautgelatine beschichtet und mit 10 µg/ml ABA-BSA-Konjugaten, 10 µg/ml BSA, dem aufgereinigten Antikörper gegen ABA (1:500) und Protein A-HRP-Konjugat (1:3000) inkubiert. Der Bindungsnachweis wurde entsprechend der Reaktionskaskade in 2.8.4 durchgeführt.

Aus Abbildung 17 ist zu erkennen, daß ABA-BSA-Konjugate mit KLH und geringfügig mit Fischhautgelantine unspezifische Bindungen eingehen. Ovalbumin erwies sich somit als das am besten geeignete Blockmittel. Keine nennenswerten Wechselwirkungen konnten für BSA, den anti-ABA-Antikörper und Protein A mit den Blocksubstanzen gemessen werden.

3.3.3 ABA-Protein-Konjugate

Um das Bindungsvermögen des ABA-BSA-Antikörpers an verschiedene ABA-Protein-Konjugate zu untersuchen, wurde ABA nicht nur an BSA, sondern auch an Ovalbumin und KLH gekoppelt. Diese Protein-Konjugate wurden auf ihre Verwendbarkeit im ELISA getestet. Eine Kopplungseffizienz wurde nur für ABA-BSA-Konjugate ermittelt. Weiterhin wurde der Einfluß von Tween 20 auf unspezifische Wechselwirkungen der Konjugate mit Proteinen gemessen.

3.3.3.1 Bindung von ABA-Protein-Konjugaten an ABA-BSA-Antikörper

Geeignete ABA-Protein-Konjugate wurden im ELISA in Hinblick auf spezifische Bindung an ABA-BSA-Antikörper untersucht. Hierfür wurden Konjugate verwendet, bei denen ABA mit BSA, Ovalbumin und KLH gekoppelt wurde. Um optimale Konzentrationsverhältnisse zwischen Antigen und Antikörper herauszufinden, wurden unterschiedliche Konzentrationen der Konjugate an die Mikrotiterplatten gebunden und mit dem Antikörper inkubiert.

Der Vergleich der Bindung des ABA-BSA-Antikörpers an unterschiedliche ABA-Protein-Konjugate zeigt einen deutlichen Unterschied in seinem Bindungsverhalten (Abbildung 18).

Eine starke Bindung des ABA-Antikörpers konnte an ABA-BSA-Konjugate und ABA-KLH-Konjugate nachgewiesen werden. Bei ABA-Ovalbumin-ABA-KLH-Konjugaten wurde darüber hinaus beobachtet, daß eine Erhöhung der Konjugat-Konzentration über 2 µg/ml zu einer verringerten Bildung von Antikörper-Konjugat-Komplexen führte. Die Ergebnisse zeigen, daß ABA-BSA und ABA-KLH-Konjugate durch den ABA-Antikörper gleichermaßen detektiert werden.

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

0,001 0,01 0,1 1 10

log (Protein-Konjugat) [µg/ml]

E (405 nm)

ABA-BSA ABA-KLH ABA-Ovalbumin

Abbildung 18: Bestimmung der Konzentrationsabhängigkeit der Bindung des ABA-BSA-Antikörpers an diverse ABA-Protein-Konjugate durch ELISA.

Die Mikrotiterplatte wurde mit Protein-Konjugaten (BSA, KLH und ABA-Ovalbumin) in Konzentrationen von 0,0032 bis 10 µg/ml beschichtet. Anschließend wurden die Konjugate mit dem aufgereinigten ABA-BSA-Antikörper (1:500) inkubiert. Ein Nachweis der gebundenen Antikörper erfolgte über Protein A-HRP-Konjugat.

Für den ELISA zum Nachweis von ABA-bindenden Proteinen wurden im Folgenden die ABA-BSA-Konjugate verwendet. Die ABA-BSA-Konjugate boten den Vorteil, daß unspezifische Wechselwirkungen des Trägerproteins BSA mit den Proteinen aus Pflanzenextrakten gemessen werden können. Dies ergibt sich daraus, daß der verwendete ABA-Antikörper sowohl die ABA-BSA-Konjugate als auch BSA detektieren kann. Der ELISA wurde so durchgeführt, daß Extrakte oder Fraktionen immer in Kontrollexperimenten mit BSA anstelle von ABA-BSA-Konjugaten inkubiert wurden. Eine unspezifische Bindung des Trägerproteins BSA an Proteine der Extrakte konnte durch die Bindung der ABA-BSA-Antikörper nachgewiesen werden. Einen analogen Vorteil boten KLH und Ovalbumin nicht, da für diese Proteine keine Antikörper erhältlich waren. Unspezifische Bindungen dieser Trägerproteine mit Proteinextrakten konnten dadurch nicht gemessen werden.

3.3.3.2 Einfluß von Tween 20 auf Protein-Wechselwirkungen

Bei einigen Experimenten wurde Tween 20 in unterschiedlichen Konzentrationen zu den Proben gegeben. Damit wurde untersucht, ob sich unspezifische Protein-Protein-Wechselwirkungen reduzieren lassen und welche Tween-Konzentration dazu notwendig ist.

Dazu wurde ein ELISA durchgeführt, wobei die Mikrotiterplatten mit Ovalbumin beschichtet und abgesättigt wurden. Anschließend wurden die Platten mit BSA unter Zugabe von verschiedenen Tween 20-Konzentrationen inkubiert. Dadurch konnte gezeigt werden, daß durch Zugabe von 0,05 % Tween 20 unspezifische Bindungen bereits deutlich reduziert wurden. Wurde kein Tween 20 dazugegeben, zeigte sich eine hohe unspezifische Bindung zwischen BSA und Ovalbumin (Daten nicht gezeigt). Dies verdeutlicht, daß sich unspezifische Wechselwirkungen zwischen Proteinen durch die Zugabe von Tween 20 deutlich reduzieren. Der ELISA zum Nachweis von ABA-bindenden Proteinen wurde daher mit ABA-BSA-Konjugaten, BSA, anti-ABA-BSA-Antikörper und Protein A unter Zugabe von 0,1% Tween 20 durchgeführt.