2. Material und Methoden
2.1 Material
2.1.2 Verbrauchsmaterialien
2.1.2.3 Oligonukleotide
Die aufgelisteten Oligonukleotide wurden von den Firmen Operon und TibMolBiol bezogen und wurden mit dem Reinheitsgrad HPSF (High Purity Salt Free) im 0,02 mmol-Maßstab synthetisiert.
Einfach und doppelt Fluoreszenz-gelabelte Oligonukleotide wurden HPLC gereinigt und die zweifach markierten Oligonukleotide zusätzlich mit der Option 3´-minor groove binder synthetisiert.
Tab.2.4: Verwendete Oligonukleotide für AI-Analysen.
Bezeichnung * Sequenz (5' → 3')
Annealing-Temperatur [°C]
Amplikon
[Bp] Literatur D7S522_F [6-FAM]GCAGGACATGAGATGACTGA
56 121 eigene
D7S522_R GTTATGCCACTCCCTCACAC
D8S258_F [6-FAM]AGCTGCCAGGAATCAACTGAGAG
56 229 eigene
D8S258_R GATGCTCACATAAAGGAGGGAGG
D16S400_F [6-FAM]GGTTCACAATTGGACAGTAT
56 179 eigene
D16S400_R GAACCCTCCATGCTGACATT
NEFL_F [6-FAM]CCAATACCTGCAGTAGTGCC
56 109 eigene
NEFL_R GAGCTGCTTAACACATAGGG
D13S153_F [6-FAM]AGGGTTATGTATAACCGACTCC
56 194 eigene
D13S153_R GTCTAAGCCCTCGAGTTGTGG
Bezeichnung * Sequenz (5' → 3') Annealing-Temperatur
[°C]
Amplikon
[Bp] Literatur D17S855_F [6-FAM]GGATGGCCTTTTAGAAAGTGG
56 151 eigene
D17S855_R ACACAGACTTGTCCTACTGCC D10S541_F [6-FAM]CACCACAGACATCTCACAACC
56 161 eigene
D10S541_R CCAGTGAATAGTTCAGGGATGG
D16S402_F [6-FAM]GTACCCATGTACCCCCAATA
56 112 eigene
D16S402_R CAAAGCACCACATAGACTAA
D16S422_F [JOEE]GAGAGGAAGGTGGAAATACA
56 122 eigene
D16S422_R GTTTAGCAGAATGAGAATAT
P53CA_F [6-FAM]AAGAAATTCCCACTGCCACTC
56 171 eigene
P53CA_R GCTGTAGAGTGAAGCTCAGGCT
CASSR1_F [6-FAM]GTTTGAAGAATTTGAGCCAACC
56 121 eigene
CASSR1_R TTCTGTCTGCACACTTGGCAC
CASSR3_F [6-FAM]AGGCCCACAGAGGAGATAACAGA
62 126 eigene
CASSR3_R CAGGTGTGGTAGATGCCAAAGAA
CASSR4_F [6-FAM]GCAACTTATCCAAACCCTGACC
62 197 eigene
CASSR4_R AGAGTGGACTAGGAAATGCTAGGAG
D7S2429_F [6-FAM]CAACTGCCCACACACATCTTTC
62 218 eigene
D7S2429_R TGGGAGCTGGGAGTCAAGTG
D7S494_F [6-FAM]AGCTATGACCACCACTGAACTCAAG
62 116 eigene
D7S494_R TGAGTCTTTGCAAAACATGCCTG
D7S499_F [6-FAM]GCAGGCTCAGTAAGTGGTTGC
62 216 eigene
D7S499_R CATGAGTGTTCCTGCTGTTTCCT
D7S2467_F [6-FAM]AAGGAGGAATTACTTGGCTGTGC
62 178 eigene
D7S2467_R GTGGTAACGGTCATCTGTGTTCG
CASSR2_F [6-FAM]CTCGAGGTCTCATCCTCTTTCCC
62 169 eigene
CASSR2_R GCAGAGGTGCACAAAGGAGTAATG
D7S2550_F [6-FAM]TTCATTCAGCTCTCCTCGTCTCAC
62 248 eigene
D7S2550_R CTAAGTTCCATTTGTCTCGGTTCCA CASSR6_F [6-FAM]AGTTCCTGACTGGGAATTCGAT
62 158 eigene
CASSR6_R TTGGCCAAATTACACACCTTTG
* F: forward Primer (sense); R: reverse Primer (antisense); [6-FAM] Fluoreszenzfarbstoff 6-FAM-phosphoramidit
Tab.2.5: Verwendete Oligonukleotide zur DNA-Sequenzierung der Exone 5-9 von TP53.
Bezeichnung * Sequenz (5' → 3')
Annealing-Temperatur [°C]
Amplikon
[Bp] Literatur p53_5/6_F CACTTGTGCCCTGACTTTC
58 477 eigene
p53_5/6_R ACTGACAACCACCCTTAACC
p53_7_F CTGCTTGCCACAGGTCTC
58 267 eigene
p53_7_R TGGAAGAAATCGGTAAGAGG
p53_ 8/9_2F TTAGGCTCCAGAAAGGACAAG 58 560 eigene
p53_8/9_2R CAGGAGCCATTGTCTTTGAG
* F: forward Primer (sense); R: reverse Primer (antisense); 2F/2R zweites Primer Set; 5/6, 7, 8/9 bezeichnen die zu amplifizierenden Exone
Tab.2.6: Verwendete Oligonukleotide zur quantitativen Analyse von DNA Genkopienzahlen:
TaqMan Assay basierte Quantifizierung von CHR2, CHR10 & EGFR
Bezeichnung * Sequenz (5' → 3')**
Annealing-Temperatur [°C]
Amplikon
[Bp] Literatur
QEGFR_F TCTGCATTCCTGCCGAGTTC
58 94 eigene
QEGFR_R GCAGTCTCCACTCCATGCTCA
QEGFR_CA+1.5k P-CAGCCCTCTGTTGGGTCACCTTCC-P
QCHR2_F TGCTGCAGGAAGCTTGAACAC 58 115 eigene
QCHR2_R CACCATCCAGGATCTGTCTGC
QCHR2FAM P-CACACTCTTCACACTCACCCTTCCATT-P
QCHR10_F CAGAGATGCGGTGTTCAGGAC 58 126 eigene
QCHR10_R CTGGCCTCATCCTTGGTATCG
QCHR10FAM P-AGGCACTTTGCAAGGAGAACCACCA-P
* F: forward Primer (sense); R: reverse Primer (antisense) ** P: Doppelt gelabeltes Oligonukleotid, 5´- 6-FAM-phosphoramidit und 3´-Black-Hole-Quencher-1a gegen 6-FAM-phosphoramidit
Tab.2.7: Verwendete Oligonukleotide zur quantitativen Analyse von DNA Genkopienzahlen: SYBR green Assay basierte Quantifizierung von Line1 & EGFR
Bezeichnung * Sequenz (5' → 3')
Annealing-Temperatur [°C]
Amplikon
[Bp] Literatur
Line-1_F AAAGCCGCTCAACTACATGG 58 149 (155)
Line-1_R TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG
qEGFR3-F TACCTGGACCTTGAGGGATTG
58 115 eigene
qEGFR3-R ACTGCGTGAGCTTGTTACTCG
qEGFR4-F CCATGACTGCAATCGTCTACC
58 62 eigene
qEGFR4-R TTGAACCCTAATGCACACGAG
qEGFR4b-F GGTCAAAGGCTAACGTGCAG 58 119 eigene
qEGFR4-R TTGAACCCTAATGCACACGAG
qEGFR5-F TACATCATGCGACCATTCCAG
58 147 eigene
qEGFR5-R TGGGCTTTGAGCAATGATTAG
qEGFR7-F CACCACTCACTGAGACCTTGG 58 52 eigene
qEGFR7-R GAAATGGAGGCATGGTAGTCC
qEGFR9-F CACCGTCATCACCTTCCTTTC
58 107 eigene
qEGFR9-R TCCTCCATCTCATAGCTGTCG
qEGFR14-F CCAAGGGAGTTTGTGGAGAAC
58 122 eigene
qEGFR14-R TGAAATGGACGTGGATAGCAG
qEGFR15-F CCTACGGGTGAGTGGAAAGTG 58 107 eigene
qEGFR15-R ACAAACCTCGGCAATTTGTTG
qEGFR16-F TGTCCAACGAATGGGTAAGTG
58 73 eigene
qEGFR16-R CCACAGCAGTGTGGTCATTC
qEGFR17-F TACATCCATCCGAGGAAATGG 58 61 eigene
qEGFR17-R CAGCTTTGTGGACATTGAAGG
qEGFR19-F TCTAGACCCTGCTCATCTCCAC
58 104 eigene
qEGFR19-R AGGCCAGTGCTGTCTCTAAGG
qEGFR20-F TCGCAAAGGTAATCAGGGAAG
58 57 eigene
qEGFR20-R GGATCCTGGCTCCTTATCTCC
qEGFR21-F AGCCATAAGTCCTCGACGTG
58 124 eigene
qEGFR21-R GAGAAGACCCTGCTGTGAGG
* F: forward Primer (sense); R: reverse Primer (antisense)
Tab.2.8: Verwendete Oligonukleotide zur quantitativen Analyse von DNA Genkopienzahlen: SYBR green Assay basierte Validierung der Tiling Array Daten für MDA-MB-468 WT
Bezeichnung * Sequenz (5' → 3')
Annealing-Temperatur [°C]
Amplikon
[Bp] Literatur
WT-F01-F CAGTCAGCACATTGACACTGG
60 108 eigene
WT-F01-R AAGTGTGGACCAGCTCTGTCTC
WT-F02-F AGCCAGCTCTTTGATTCTTGG
60 109 eigene
WT-F02-R CAAAGGAAACCTATTGCAAGC
WT-F03-F TCTGTAGCTCATGGATTACTTGG
60 209 eigene
WT-F-03-R TACCCGTGGGCTGTGTACC
WT-F04-F GAATCCAGGTCAAACCATGTG 60 105 eigene
WT-F04-R TACACAGATGCCTGCTCAAAG
HERV-K1-F CCAAAGAAGAGACTCTGAGAGGAC
60 59 eigene
HERV-K1-R AGTCTTGACATGGCTGTTATTGAG
HERV-K2-F GAAATCCAAGCTGTATGTTCAATG
60 268 eigene
HERV-K2-R ATTAGAAGTCAGCCTAATGCCATC
WT-F05-F GGCTCCCATGATTCTCCTG 60 219 eigene
WT-F05-R GGGCAACACTGAGCATTAAG
N-WT-F01-F AACCAGCCATATTCCATTCATC
60 212 eigene
N-WT-F01-R GCCCAAAGTCAGGTCATATACAG
N-WT-F02-F TCACCCAAGTCGTGTATGTCAG 60 251 eigene
N-WT-F02-R
N-WT-F03-F CCACTCTCGAAATTGTTCAGC AAGAAAGGTGATGAGCATGGAC
60 50 eigene
N-WT-F-03-R CCCTTAAATTTGAGAACAAGTGG N-WT-F04-F GAAAGCATTTCAGCCTTTCAC
60 174 eigene
N-WT-F04-R CACATGTTCAAATGAATTGATGC N-WT-F05-F TTCTTTGCACATTAAATTGTTTG
60 111 eigene
N-WT-F05-R AGAGGAATAGGCAGATCAATGG
N-WT-F06-F ACTGTTCTTGGGTAGATTGTTCTG
60 257 eigene
N-WT-F06-R TGTTGGTCGTTGTATTTGTTTC
N-WT-F07-F TTTAGAAGATGGATTGGTGAGGAG 60 50 eigene
N-WT-F07-R CCTGTTCTTGTTCTGACCATTG
WT-E01-F CTCCAGAAGCCCTGACATTG
60 91 eigene
WT-E01-R CTTCCTCCTATCCCTCACTGC
WT-E02-F CTGGGAGGACAAGGTAAGAGG 60 208 eigene
WT-E02-R AATGGTGGAGTCACAGCTCAC
N-WT-E01-F GGGACCACATCTTACTCTCCAG
60 149 eigene
N-WT-E01-R ACAGCACCTTCCTCCTTACATC
N-WT-E02-F AGGAGAGTGCAGTGAGGGATAG
60 71 eigene
N-WT-E02-R ACAGCACCTTCCTCCTTACATC
N-WT-E03-F TACCAACAGTTCTCCCTCATCC 60 144 eigene
N-WT-E-03-R AGTCTGCGGTGTAGAGGAAATC N-WT-E04-F ATATAGATTCGGCAGCCTTCAG
60 120 eigene
N-WT-E04-R TCCAATATCCAAGAGGCAGAAC
N-WT-E04-R TCCAATATCCAAGAGGCAGAAC
N-WT-E05-F TCCTCAAAGATTGGTTTGTTTG
60 288 eigene
N-WT-E04-R TCCAATATCCAAGAGGCAGAAC
* N-: Nachdesign; WT: MDA-MB-468 WT; F0x: telomerseitige Amplikongrenze; E0x centromerseitige Amplikongrenze; F: forward Primer (sense); R: reverse Primer (antisense)
Tab.2.9: Verwendete Oligonukleotide zur quantitativen Analyse von DNA Genkopienzahlen: SYBR green Assay basierte Validierung der Tiling Array Daten für MDA-MB-468 0106 Bezeichnung
* Sequenz (5' → 3') Annealing-Temperatur
[°C] Amplikon
[Bp] Literatur 0106-F01-F CGGGTCATTGCTTTACAGG
60 300 eigene
0106-F01-R TGGGTTCTGAAGGATGGTTG 0106-F02-F ACATCCCTAGCACAGGCATC
60 60 eigene
0106-F02-R CAGAAAGCAGCACCTCACAC 0106-F03-F ATTTGGGAAGAGCCACGAG
60 65 eigene
0106-F03-R AATCCCAGATTTGGGTAGGG WT-F01-F CAGTCAGCACATTGACACTGG
60 108 eigene
WT-F01-R AAGTGTGGACCAGCTCTGTCTC WT-F02-F AGCCAGCTCTTTGATTCTTGG
60 109 eigene
WT-F02-R CAAAGGAAACCTATTGCAAGC 0106-E01-F CTACGGGCAGAGGGTTCAG
60 221 eigene
0106-E01-R CACAGACAGTTCGTGCAAATC 0106-E02-F GCCACATCAGAGCCATAAGC
60 124 eigene
0106-E02-R N0106-E1-F
TTCCAAGAAGGTCTGTGAGGAC CCTCCTATCCAATGGTCTCTCTC
60 55 eigene
N0106-E1-R TTCCTCCTCTGCAAGTAAGTCAG N0106-E2-F GTCTCAAAGTAAATGTGGGATGTG
60 107 eigene
N0106-E2-R TCACCAAACCATATCATATTCAGC N0106-E3-F TTTCCCACCTAAAGATAGGATTTG
60 265 eigene
N0106-E3-R TATTGAGTCATTGCTGTACCCATC N0106-E4-F TGGCTGTCTGTGTATGTCTGTATG
60 224 eigene
N0106-E4-R AGGGAGAGTATTCACACATGCTTC
* N-: Nachdesign; 0106: MDA-MB-468 0106; F0x: telomerseitige Amplikongrenze; E0x centromerseitige Amplikongrenze; F: forward Primer (sense); R: reverse Primer (antisense)
Tab.2.10: Verwendete Oligonukleotide zur quantitativen Analyse von DNA Genkopienzahlen: SYBR green Assay basierte Validierung der Tiling Array Daten für MDA-MB-468 0107 Bezeichnung
* Sequenz (5' → 3') Annealing-Temperatur
[°C] Amplikon
[Bp] Literatur 0107-F01-F CCATGATTCGGGATATGGTC
60 132 eigene
0107-F01-R GGACTCAAACATCTTTAGCCAAC 0107-F02-F ATTGGTGAGGAGCAGACAATG
60 73 eigene
0107-F02-R TGGTTTGACCTGGATTCACTC 0107-F03-F CTGCATCCCAGCTACATCAG
60 78 eigene
0107-F03-R ACACCCTGTAAAGCAATGACC 0107-F04-F GCTCACCAGCACTACCTTCTG
60 121 eigene
0107-F04-R AGAAAGCAGCACCTCACACTC N-0107-F01-F GCACTTTGTTTGACTTTGTAGGG
60 143 eigene
N-0107-F01-R TTGAACTAAGAAACCAAGGAAGC 0107-E01-F CATGGGTATTGAGGCTCTTTG
60 160 eigene
0107-E01-R ATTGTCCACCAGACAGCTGAG 0107-E02-F TACCTCCTCACAACGTCCATC
60 124 eigene
0107-E02-R TGAAGCCAGAATACCACCAAG
0107-E03-F GTTTGAATGTGGTTTCGTTGG 60 115 eigene
0107-E03-R CCTGTGAGCTGAAGAGTGAGG
* N-: Nachdesign; 0107: MDA-MB-468 0107; F0x: telomerseitige Amplikongrenze; E0x centromerseitige Amplikongrenze; F: forward Primer (sense); R: reverse Primer (antisense)
Tab.2.11: Verwendete Oligonukleotide zur quantitativen Analyse von DNA Genkopienzahlen: SYBR green Assay basierte Validierung der Tiling Array Daten für MDA-MB-468 +
Bezeichnung * Sequenz (5' → 3')
Annealing-Temperatur [°C]
Amplikon
[Bp] Literatur
MDA+F01-F TGGTTCATCAACTTGGTAGGG
60 160 eigene
MDA+F01-R TTCCGCAATAAGCATGTGAG
MDA+F02-F ACCAGTGTCACCACAAATGC
60 58 eigene
MDA+F02-R CTTAGCCTTCCCAGTGTTGC
MDA+F03-F AAATTGGCAGCAACAGCAC
60 166 eigene
MDA+F03-R TTCACTGCCTGAAACTGTGG
MDA+F04-F CCTGCCTGACTTACCCACTC 60 250 eigene
MDA+F04-R TTATGGAAAGGAGCGTGGAG
MDA+E01-F CTGCGTAGGACCTTGCTTTC
60 65 eigene
MDA+E01-R GACGTTGTGAGGAGGTAGGC
MDA+E02-F TCGTTGGAAGCAAATGTGTC
60 245 eigene
MDA+E02-R CTTACCAGGCAGTCGCTCTC
MDA+E03-F CGTGTGGGTCAGGTACTTTG 60 284 eigene
MDA+E03-R
MDA+E04-F CTCATAACGAGGCTGCTTCC
TGCTCTTTGCTTCCATGTTG
60 209 eigene
MDA+E04-R CATCTATCCACCACCCAACC
N-MDA+E01-F AATGTGGTTTCGTTGGAAGC 60 122 eigene
N-MDA+E01-R GAGCAAAGGTTCCCTGTGAG N-MDA+E02-F GAATGGATAGAGGGACAGGTTG
60 59 eigene
N-MDA+E02-R ACTTCAAAGGTGTGGGTTCATC N-MDA+E03-F GTTGTGTCACCACCAGATCAAG
60 124 eigene
N-MDA+E03-R CAACCTGTCCCTCTATCCATTC N-MDA+E04-F AAGGTGGTCTGGAGAAACAAAG
60 139 eigene
N-MDA+E04-R GCGTAATCCCAAGGATGTTATG N-MDA+E05-F CACATCTTATCACAGGGACCAG
60 99 eigene
N-MDA+E05-R GTGAGCACCTGCATGTCTATTC
N-MDA+E06-F TACCATGCCTCCATTTCCTTAC 60 100 eigene
N-MDA+E06-R GTCCTAATGACGGACATCACAG
* N-: Nachdesign; +: MDA-MB-468 +; F0x: telomerseitige Amplikongrenze; E0x centromerseitige Amplikongrenze; F: forward Primer (sense); R: reverse Primer (antisense)
Tab.2.12: Verwendete Oligonukleotide zur Charakterisierung der telomerwärts gerichteten Amplikongrenze von MDA-MB-468 WT
Bezeichnung * Primerkombination Nr.
Annealing-Temperatur [°C]
Amplikon
[Bp] Literatur
N-WT-F7-F 1 60 8071 eigene
HERV-K1-R N0107-F1-F
2 60 6426 eigene
HERV-K1-R N-WT-F3-F
3 60 4192 eigene
N-WT-F7-R WT-F3-F
4 60 2669 eigene
N-WT-F7-R WT-F5-F
5 60 2021 eigene
N-WT-F7-R
Bezeichnung * Primerkombination Nr. Annealing-Temperatur
[°C]
Amplikon
[Bp] Literatur
N-WT-F1-F 6 60 1119 eigene
WT-F3-R N-WT-F1-F
7 60 1397 eigene
N-WT-F6-R N-WT-F1-F
8 60 1777 eigene
WT-F5-R N-WT-F1-F
9 60 3579 eigene
N-WT-F7-R N-WT-F6-F
10 60 2439 eigene
N-WT-F7-R
HERV-K1-F 11 60 2611 eigene
HERV-K2-R HERV-K2-F
12 60 3873 eigene
0106-F2-R
* N-: Nachdesign; +: MDA-MB-468 +; F0x: telomerseitige Amplikongrenze; E0x centromerseitige Amplikongrenze; F: forward Primer (sense); R: reverse Primer (antisense)
Tab.2.13: Verwendete TaqMan® Gene Expression Assays für die Genexpressionsmessungen von EGFR, CHCHD2 und B2M in MDA-MB-468 und deren Subklonen
Assay ID Zielgen* Hersteller
Hs00193306_m1 EGFR Applied Biosystems, Darmstadt
Hs00853326_g1 CHCHD2 Applied Biosystems, Darmstadt
Hs99999907_m1 B2M Applied Biosystems, Darmstadt
* EGFR: Epidermaler Wachstumsfaktor Rezeptor; CHCHD2: coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 2; B2M: Beta-2-Mikroglobulin