II. 2.2.11.3 Nachweis der Translationseffizienz von Reporter-RNAs
VII.1 Oligonucleotide
Die verwendeten Oligonucleotide zur Amplifikation von DNA-Fragmenten für die Generierung von Expressionsplasmiden, qRT-PCR-Untersuchungen, in vitro-Transkriptionen und das toe printing sind in Tab. VII-1 aufgelistet.
Tab. VII-1: Sequenz und Schmelztemperatur der verwendeten Oligonucleotide. Die Schmelztemperatur der Oligonucleotide bezieht sich auf die komplementären Bereiche zum DNA-template und beinhaltet nicht die Sequenzen von Restriktionsenzymen am 5’Ende, des T7-Promoters und des Flag-tag, sofern diese nicht in den DNA-templates vorhanden sind. fw: forward, rv: reverse, Tm: Schmelztemperatur (IIT-Biotech).
Name und
Verwendung Sequenz 5’-3’ Tm in °C
Konstruktion der Expressionsplasmide
DDX3fw AGTCATGTGGCAGTGGAAAATGC 61,0
DDX3rvORF TTCTCGAGTCAGTTACCCCACCAGTCAACC 60,9
DDX3fwFlag CGGGGTACCGCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGC
CCGGGCGGATAGTCATGTGGCAGTGGAAAATGC 61,0
DDX3rvMut1 ACGAGTAAGCTCAATGTTTCCCATG 60,1
DDX3fwMut1 GCTACTCGCCCAACTCCAGTGGCAAAGCATGCTATTCC 72,3
DDX3rvMut2 TCCAGACCCTGTTTGGGCAC 65,4
DDX3fwMut2 GCAACTGCAGCATTTCTGTTGCCC 64,2
DDX3rvMut3 TAACACCAAGTATTTGCAAAAGTCTAATCC 57,7
DDX3fwMut3 GCTGCAGCTGATCGGATGTTGGATATGG 66,2
pcDNA3fw TGACTCGAGCATGCATCTAGAGGG 60,9
DDX3rv1236nt AGAGGTAGAGCCAACTCTTCCTAC 61,2
DDX3rv1749nt GCTACCCTTGTAGTGGTGTTCATAAGC 61,9
DDX3fw388 AAATCAGATGAAGATGATTGGTCAAAACCACTC 61,6
DDX3fw301 CGGAGTGATTACGATGGCATTGG 61,7
DDX3fw220 TCTCGTAGTGATTCAAGAGGGAAGTC 61,6
DDX3fw142 GCTACTAAAGGTTTCTACGATAAAGACAGTTCAG 60,3
DDX3fw88 GGAAGTACAGCCAGCAAAGGG 62,5
pcDNA3rv GAATTCCTTGTCGTCGTCCTTGTAGTC 62,7
eIF1fw ATGTCCGCTATCCAGAACCTCC 62,9
eIF1rv CCCAAGCTTAAAACCCATGAACCTTCAGCTGATCG 62,3
eIF1Afw ATGCCCAAGAATAAAGGTAAAGGAGG 60,4
eIF1Arv CCCAAGCTTAGATGTCATCAATATCTTCATCATCATCTCCAATGTC 61,0
eIF4Afw ATGTCTGCGAGCCAGGATTCCCG 67,9
eIF4Arv CCCAAGCTTCAGATGAGGTCAGCAACATTGAGG 62,5
eIF4Bfw ATGGCGGCCTCAGCAAAAAAGAAGAATAAGAAGG 66,2
eIF4Brv CCCAAGCTTCTATTCGGCATAATCTTCTCCCTCATTTTCATC 61,5
eIF4Gfw737-1116 AGCAGCAAGCGGACGGCGGCTG 72,2
eIF4Grv737-1116 CCCAAGCTTAAGCTGGGCGAGCAGCTTCTGATGC 68,6
eIF5fw ATGTCTGTCAATGTCAACCGCAGC 65,5
eIF5rv CCCAAGCTTAAATGGCATCAATATCGATGTCGTCATCC 60,9
128 Name und
Verwendung Sequenz 5’-3’ Tm in °C
eIF5Bfw587-1220 ATGAGCTCAGATTCTGAATATGACTCTGATG 60,0
eIF5Brv587-1220 CCCAAGCTTAGATGATTTCAAATACTTTCTTCAGCTCCAC 59,0
eIF1fwFlag CCCAAGCTTGCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGC
CCGGGCGGATTCCGCTATCCAGAACCTCC 62,9
eIF5fwFlag CCCAAGCTTGCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGC
CCGGGCGGATTCTGTCAATGTCAACCGCAGC 61,0
eIF5BfwFlag CTAGCTTAAGCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGC
CCGGGCGGATGGGAAGAAACAGAAAAACAAGAGCG 60,2
Meti-tRNASynfw ATGCCTACTATGACTCAAGTCGCG 60,9
Meti-tRNASynrv TTATTTCACCTGATGACCCGGTTTAGC 62,2
Generierung des HDV-Ribozyms in pSGR-JFH1 und pSGR-JFH1/mono
JFH1rvRibo1 GTAGCCCAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGAC
CCACATGATCTGCAGAGAGACCAG 59,7
JFH1rvRibo2 GCTCTAGACTTCTCCCTTAGCCTACCGAAGTAGCCCAGGTCGGAC
CGCGAGGAG 74,4
JFH1fwRibo GCCGATATCTCTTCAATTGGGCGGTG 65,5
Konstruktion von pSGR-JFH1/mono
JFH1CoreSL1rv GTTTAAACCGCCGCCGCCCGGGAACTTAACGTCTTCTGGGCGACG
GTTGGTGTTTC 79,4
JFH1NS3fw GCTCCCATCACTGCTTATGCC 61,7
Ubiquitinfw ATGCAGATCTTCGTGAAAACCCTTACCGGCAAGACCATCACCCTT
GAGGTGGAGCCCAGTGACACCATCGAAAATGTG 62,4
Ubiquitinrv1 GATGAGCCTCTGCTGGTCGGGGGGAATGCCTTCCTTATCCTGGAT
CTTGGCCTTCACATTTTCGATGGTGTCACTGGG 62,4
Ubiquitinrv2 CCTTCTGGATGTTGTAGTCAGAAAGAGTACGGCCGTCTTCCAGCT
GCTTGCCTGCAAAGATGAGCCTCTGCTGGTCGG 65,0
Ubiquitinrv3 ACCACCTCTCAGACGCAGGACCAGGTGCAGGGTCGACTCCTTCTG
GATGTTGTAGTCAGAAAGAG 60,6
Konstruktion von pHCV-5’UTR-Luc-3’UTR und pHCV-5’UTR-sORF-3’UTR
JFH1SLStopfw CTCCCCGCTCGGTAGAGC 65,4
JFH1CoreSL1rv GTTTAAACCGCCGCCGCCCGGGAACTTAACGTCTTCTGGGCGACG
GTTGGTGTTTC 79,4
Konstruktion von pHCV-5’UTR∆SLIII-sORF-3’UTR
JFH1∆SLIIIfw CCCCGGGAGGTCTCGTAGAC 68,4
JFH1∆SLIIIrv CTCCCGGGAGGGGGGGGCCTGG 85,1
qRT-PCR
Reverse Transkription (RT)
JFH1rvRT CGCTCTAAGCCTGACGGTG 61,8
EMCVLucrvRT CGATATCCATATGGGTGGTGGC 61,7
Luciferaserv CACGGCGATCTTTCCGCCC 66,3
Oligo(dt)19 TTTTTTTTTTTTTTTTTTT 38,9
qPCR
GAPDHfw AGCCTCAAGATCATCAGCAATGC 60,1
GAPDHrv ATGGCATGGACTGTGGTCATG 61,3
JFH1-1-fw TCGACGTTGTTACAAGGTCTCC 60,6
129 Name und
Verwendung Sequenz 5’-3’ Tm in °C
JFH1-1-rv CTGCCAGTTGGAGCATGC 60,2
Luciferasefw AGACGAACACTTCTTCATAGTTGACCG 61,4
Luciferaserv GCGTCGAAGATGTTGGGGTG 63,1
WNV-3’UTRfw GGAAGGAGGACCCCACATG 64,4
WNV-3’UTRrv CGCAGACTGCACTCTCCG 62,2
HSP70fw CATCAGCGGACTGTACCAGG 61,9
HSP70rv CCTAATCTACCTCCTCAATGGTGG 61,2
rpS13fw CATCATGGGTCGCATGCATGC 63,0
rpS13rv GTCAACTTCAACCAAGTGGGGAC 62,3
Konstrukte amplifiziert durch PCR HCV-5’UTR-Luc-
JFH1-2-fwT7 AGTGAATTCTAATACGACTCACTATAGACCTGCC 62,3
Luciferaserv2 GTACGTACTTAGTCATTACACGGCGATCTTTCCGCCC 66,3
EMCV-5’UTR-Luc-poly(A)
EMCV-Lucrvpoly(A)
GAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTCTTGCATGCCTGCAGGTCG
62,8
pCITEfw CAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCG 62,1
5’cap-sORF-poly(A)
5’capsORFfwT7 CCGGAGTGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGGGAATTGG 60,8
5’capsORFrv TCGAGGTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGACGGT
ATCGATAAGCTTGATATCG 62,2
HCV-5’UTR-sORF-3’UTR
JFH1-2-fwT7 AGTGAATTCTAATACGACTCACTATAGACCTGCC 62,3
JFH1-2-rv ACATGATCTGCAGAGAGACCAG 59,7
tRNAiMet
tRNAiMet AGCAGAGTGGCGCAGCGGAAGCGTGCTGGGCCCATAACCCAGAG
GTCGATGGATCTAAACCATCCTCTGCTACCA
tRNA-Meti∆CC AGCAGAGTGGCGCAGCGGAAGCGTGCTGGGCATAACCCAGAGGT
CGATGGATCTAAACCATCCTCTGCTACCA
tRNA-Meti-fwT7 CCGGAGTGAATTCTAATACGACTCACTATAAGCAGAGTGGCGCA
GCGG 66,7
tRNA-Meti-rv TGGTAGCAGAGGATGGTTTAGATCC 61,8
toe printing
5’capsORFrv2 GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC 58,7
JFH1-3-rv TGTGTGCCGCTCTACCGAG 63,3
130 VII.2 siRNAs
Die in dieser Arbeit verwendeten siRNAs sind in Tab. VII-2 aufgeführt.
Tab. VII-2: Sequenzen der verwendeten siRNAs
Name Sequenz 5’-3’
siGFP GGCUACGUCCAGGAGCGCACCdTdT
siDDX3-1 UGAGCUUACUCGUUAUACUdTdT
siDDX3-2* UGGAAGGUAUGGGCGCCGCdTdT
* verwendet aus Randall et al. (2007)
131 PUBLIKATIONSLISTE
Teile der vorliegenden Doktorarbeit bzw. verwendete Methoden sind in folgende Veröffent-lichungen und Tagungsbeiträge eingegangen.
VERÖFFENTLICHUNGEN IN FACHZEITSCHRIFTEN
Geißler R., Golbik RP. & Behrens SE. (2012) The DEAD-box helicase DDX3 supports the assembly of functional 80S ribosomes. Nucleic Acids Res: in press
Geißler R., Scholze H., Hahn S., Streubel J., Bonas U., Behrens SE. & Boch J. (2011) Transcriptional activators of human genes with programmable DNA-specificity. PloS ONE 6: e19509
Reich S., Golbik RP., Geißler R., Lilie H. & Behrens SE. (2010) Mechanisms of activity and inhibition of the hepatitis C virus RNA-dependent RNA polymerase. J Biol Chem 285: 13685-93
Ziegler J., Facchini PJ., Geißler R., Schmidt J., Ammer C., Kramell R., Voigtländer S., Gesell A., Pienkny S. & Brandt W. (2009) Evolution of morphine biosynthesis in opium poppy. Phytochemistry 70: 1696-707
Ziegler J., Brandt W., Geißler R. & Facchini PJ. (2009) Removal of substrate inhibition and increase in maximal velocity in the short chain dehydrogenase/reductase salutaridine reductase involved in morphine biosynthesis. J Biol Chem 284: 26758-67 Geißler R., Brandt W. & Ziegler J. (2007) Molecular modeling and site-directed
mutagenesis reveal the benzylisoquinoline binding site of the short-chain dehydrogenase/reductase salutaridine reductase. Plant Physiol 143: 1493-503
TAGUNGSBEITRÄGE - VORTRÄGE
Geißler R.: The function of DDX3 in the cap- and IRES-dependent translation initiation process. DFG Forschergruppe 855 “Cytoplasmic regulation of gene expression“, 15.-16.03.2011, Tübingen, Deutschland.
TAGUNGSBEITRÄGE - POSTER
Geißler R., Patel A. & Behrens SE.: DDX3 is an auxiliary factor of hepatitis C virus IRES-mediated translation. “18th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses”, 08.-12.09.2011, Seattle, WA, USA.
Winkler E., Aurich H., Geißler R., Mensch A., Stöhr N., Friedrich S., Hüttelmaier S. &
Behrens SE.: Hepatitis C virus replication induces expression of vascular endothelial growth factor and accelerates vascularisation of human hepatoma. “18th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses”, 08.-12.09.2011, Seattle, WA, USA.
132 Friedrich S., Geißler R. & Behrens SE.: Cellular RNA-binding proteins are involved in West Nile virus RNA replication. “The complex life of mRNA: From synthesis to decay”, 18.-20.03.2010, Heidelberg, Deutschland.
Friedrich S., Geißler R. & Behrens SE.: Cellular RNA-binding proteins are involved in West Nile virus RNA replication. “16th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses”, 03.-07.10.2009, Nizza, Frankreich.
133
DANKSAGUNG
Ich möchte mich bei allen Personen bedanken, die mich während der Anfertigung meiner Doktorarbeit unterstützt haben und somit zum Gelingen beitrugen.
An erster Stelle danke ich Herrn Prof. Dr. Sven-Erik Behrens für das Ermöglichen dieser Dissertation in seiner Abteilung. Sein unermüdliches Interesse an meiner Arbeit, seine stete Diskussionsbereitschaft und die kompetente Betreuung waren ausschlaggebend für die Entstehung dieser Arbeit.
Ich bedanke mich bei allen derzeitigen und ehemaligen Mitgliedern der Abteilung Mikrobielle Biotechnologie, in der ich die vorliegende Arbeit angefertigt habe, für die angenehme Arbeitsatmosphäre und gute Zusammenarbeit. Mein spezieller Dank gilt an Christine Hamann für die exzellenten Arbeitsbedingungen in der Zellkultur und PD Dr. Ralph Golbik für seine stetige Diskussionsbereitschaft, die vielen Anregungen zu dieser Arbeit sowie das Korrekturlesen.
Herrn PD Dr. Thomas Vogt vom Leibniz-Institut für Pflanzenbiochemie in Halle möchte ich vielmals für das Korrekturlesen dieser Arbeit danken.
Herrn Dr. Arvind H. Patel von der Universität von Glasgow und Prof. Dr. Stefan Hüttelmaier von der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg danke ich für die Bereitstellung des anti-DDX3-Antiserums und des IGF2BP1/2-Antikörpers.
Bei Prof. Dr. Takaji Wakita vom National Institute of Infectious Diseases in Tokyo, Dr. Antje Ostareck-Lederer von der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule in Aachen, Dr.
Christiane Harnisch und Susann Friedrich möchte ich mich für diverse zur Verfügung gestellte Plasmide bedanken.
Herrn Prof. Dr. Reinhard Lührmann vom Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie in Göttingen danke ich für die Bereitstellung des cytoplasmatischen HeLa-Extrakts.
Mein größtes Dankeschön gilt meiner Familie, meinen Eltern, meiner Schwester Ramona, Doreen und besonders Dany. Ihnen danke ich für die Liebe, die ständige Unterstützung in allen Lebenslagen und für das unentwegte Korrekturlesen.
- D A N K E -
134 LEBENSLAUF
Angaben zur Person
Name René Geißler
Wohnort Sternstr. 6
06108 Halle (Saale)
Geburtstag 30.12.1980
Geburtsort Parchim
Staatsangehörigkeit Deutsch
Familienstand ledig
Schulbildung
1987 bis 1993 Grundschule 3, Guben
1993 bis 2000 Pestalozzi Gymnasium, Guben Abschluss: Abitur
Grundwehrdienst 2000 bis 2001 Studium
2001 bis 2006 Studium der Biochemie an der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Diplomarbeit am Leibniz-Institut für Pflanzenbiochemie (IPB), Abteilung Naturstoff-Biotechnologie, Arbeitsgruppe Papaver-Genexpressionsanalyse, Halle (Saale) mit dem Thema:
„Untersuchungen zur Katalyse und Substratbindung der Salutaridin-Reduktase aus Papaver bracteatum L.“
Abschluss: Diplom-Biochemiker (Note 1,0) Berufstätigkeit
01.11.2006-14.10.2007 Wissenschaftlicher Mitarbeiter am Leibniz-Institut für Pflanzenbiochemie (IPB), Abteilung Sekundärstoffwechsel, Arbeitsgruppe Proteinbiochemie und Metabolite Profiling, Halle (Saale)
Seit 15.10.2007 Wissenschaftlicher Mitarbeiter an der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Naturwissenschaftliche Fakultät I, Institut für Biochemie und Biotechnologie, Abteilung Mikrobielle Bio-technologie
Halle (Saale), den
--- René Geißler