3.2.1 Coletalität von SEC72 in Kombination mit ∆sbh1
In den bisherigen Untersuchungen wurde der Beitrag verschiedener Domänen von Sec71p zur Assoziation von Sec71p mit dem SEC-Komplex, zur Komplementationsfähigkeit eines
∆sec71/∆sbh1-Stamms und ihr Beitrag zur Sec72-Bindung untersucht. Dabei fällt auf, daß die Fähigkeit C-terminal verkürzter Sec71p-Varianten einen ∆sec71/∆sbh1-Stamm zu komplementieren mit der Sec71p-vermittelten Bindung von Sec72p an die Membran einhergeht. Daraus ergab sich die Frage, ob das Ausbleiben der Assoziation von Sec72p mit dem SEC-Komplex im ∆sec71/∆sbh1 –Hintergrund entscheidend für den letalen Phänotyp ist.
Dazu sollte zuerst eine ∆sec72/∆sbh1 –Doppelnullmutante erzeugt werden. Die haploiden Stämme YUC 6 (∆sec72) und YKF 8 (∆sbh1) wurden gekreuzt, diploide Klone sporuliert und einer Tetradenanalyse unterzogen. In mehreren Anläufen gelang es nicht, lebensfähige Sporen, die beide Selektionsmarker trugen, zu finden. Daraufhin wurde der diploide Stamm aus YUC 6 x YKF 8 mit einem für SEC72 codierenden Plasmid, das einen URA3-Marker trägt (pCU 085), transformiert, sporuliert und erneut in Sporen segregiert. Es wurden vollständige Tetraden erhalten, mit einzelnen Sporen, die alle 3 Marker trugen.
3 Ergebnisse 55 -Diese Sporen (YUC 15 + pCU 085) wurden zusammen mit einer Reihe von Kontrollen über Nacht in YPD angezogen, um ihnen die Möglichkeit zu geben, das URA-Plasmid zu verlieren. Anschließend wurden die Kulturen sowohl auf SD- als auch auf SD + 5´FOA-Platten ausgestrichen und für 2-3 Tage bei 30°C inkubiert.
Abb. 14 zeigt das Ergebnis. Die durch pSEC72URA komplementierte Doppelmutante
∆sec72/∆sbh1 ist auf das URA-Plasmid angewiesen und kann somit nicht auf SD + 5´FOA wachsen. Die Doppeldeletion ∆sec72/∆sbh1 ist daher letal (siehe auch Kapitel 4.4). Das bedeutet, daß ein ∆sbh1 Stamm mit einer Sec71p-Verkürzung, die kein Sec72p binden kann, zwangsläufig letal sein muß, da ∆sec72/∆sbh1 letal ist. Und wie schon bei der ∆sec71/∆sbh1 Doppelnullmutante, ist auch im Falle von ∆sec72/∆sbh1 der endogene Proteingehalt an Sbh2p nicht in der Lage zu komplementieren.
wt
∆sec72
∆sbh1
∆sec72
∆sbh2 pSEC72URA
∆sec72
∆sbh1 pSEC72URA
∆sbh2
SD SD, 5'FOA
Abb. 14: Genetische Interaktion von SEC72 und SBH1. Hefestämme wie im Schema links angegeben wurden über Nacht in Vollmedium angezogen, auf SD- bzw. SD + 5´FOA-Platten ausgestrichen und für 2-3 Tage bei 30°C inkubiert.
3.2.2 Eine C-terminale TPR-Domäne des Sec72p ist essentiell für seine Funktion.
Sec72p ist ein 193 Aminosäure langes Protein, das nahe dem C-Terminus eine Domäne enthält, die eine Ähnlichkeit zu „Tetratricopeptide repeat Domänen“ (TPR-Domänen) aufweist (Abb. 15). TPR-Domänen sind als Protein-Interaktionsdomänen beschrieben. In der Regel kommt die Konsensussequenz aus 34 Aminosäuren zwischen drei und zwölf Mal in einem Protein vor (Für einen Überblick siehe Goebl und Yanagida, 1991). Proteine mit TPR-Domänen sind beteiligt an Mitose, Transkription und auch am Proteinimport in
3 Ergebnisse 56 -Mitochondrien und Peroxisomen. S.c.Tom70p als Teil des mitochondrialen Translokations-komplexes ist ein Protein mit 7 TPRs (Woolford, 1989) und S.c.Pas10p interagiert mit der peroxisomalen Targetingsequenz und ist ebenfalls ein Protein mit mehreren TPR Domänen (Brocard et al., 1994). Außerdem zeigten Radanyi et al. (1994), daß das Immunophilin FKBP59-HBI mit Hsp90p durch seine TPR-Domänen interagiert. Aufgrund dieser Hinweise wurde die TPR-Domäne des Sec72p deletiert und das entstehende Sec72∆TPRp auf seine Funktionalität getestet.
1 MVTLEYNANS KLITASDAVV ALSTETNIDQ INVLTTSLIG 41 ETNPNFTPQP NEALSKMIKG LFESGMKNLQ QKKLNEALKN 81 VSLAIEMAQR KRAPWEAFAI QLPELHFMLR SKIDLCLILG 121 KHLEALQDLD FLLGTGLIQP DVFVRKADCL LKLRQWEEAR 161 ATCERGLALA PEDMKLRALL IETARNLAEY NGE
Abb. 15: Aminosäuresequenz von S.c. SEC72. Die Tetratricopeptide Domäne (TPR-Domäne) ist grau unterlegt, die Lsyine sind f ett dargestellt.
Mittels PCR wurde ein entsprechendes low-copy Plasmid konstruiert, das SEC72∆TPR hinter dem endogenen Promotor codiert (pCU 065). Dadurch sollte verhindert werden, daß eine erhöhte Proteinkonzentration an Sec72∆TPRp einen möglichen Defekt suppremiert. Als Positivkontrolle diente ein identisches Plasmid mit dem intakten Gen (pCU 060).
Beide Plasmide wurden in den YUC 15 Hefestamm transformiert, der durch ein pSEC72URA komplementiert wurde. Als Negativkontrolle wurde das Ausgangsplasmid (pRS 415) mitgeführt. Transformanten aller drei Klone wurden über Nacht in YPD angezogen, um ihnen die Möglichkeit zu geben, daß komplementierende pSEC72URA zu verlieren. Dann wurden die Klone auf SD- bzw. SD + 5´FOA-Platten ausgestrichen und 2-3 Tage bei 30°C inkubiert (Abb. 16). SEC72∆TPR kann YUC 15 nicht komplementieren, das intakte SEC72 ist dazu in der Lage. Somit ist die TPR-Domäne des Sec72p von Bedeutung für seine Funktion.
Aufgrund der entfernten Homologie zu anderen TPR-Domänen und der aufgeklärten Funktion dieser Proteine kann man daher die Hypothese aufstellen, daß die TPR Domäne von Sec72p für die Interaktion mit cytosolischen Proteinen wichtig ist.
3 Ergebnisse 57
-SD SD, 5'FOA
Ohne Plasmid Nur
Plasmid
pSEC72 pSEC72∆TPR
Stammhintergrund: ∆sec72, ∆sbh1, pSEC72URA
Abb. 16: Genetische Untersuchung zur Rolle der TPR-Domäne des Sec72p in Abwesenheit von SBH1.
Transformanten von YUC15 + pSEC72URA (∆sec72/∆sbh1 + pSEC72URA) mit pSEC72, mit pSEC72∆TPR und mit pRS415 (Ausgangsvektor) wurden über Nacht in Vollmedium angezogen, auf SD- bzw. SD + 5´FOA-Platten ausgestrichen und 2-3 Tage bei 30°C inkubiert.
3.2.3 Die Deletion der TPR-Domäne ändert nicht die Lokalisierung von Sec72∆TPRp.
Um auszuschließen, daß die Deletion der TPR-Domäne Sec72p instabilisiert hat, und es deswegen degradiert wurde, oder nicht mehr korrekt an die Membran assoziiert ist, wurde die Lokalisierung und die Art der Bindung von Sec72∆TPRp im Vergleich zum wt-Protein untersucht. Wie bereits erwähnt, zeichnet sich die Assoziation von Sec72p an die Membran vor allem durch ihre Hochsalz-Resistenz und ihre Alkali-Beständigkeit aus. Sollte Sec72∆TPRp sich ähnlich verhalten, so wäre davon auszugehen, daß es sich um eine korrekte Membranassoziation handelt.
Membranen von Transformanten von YUC 6 (∆sec72) mit pCU 060 (pSEC72), bzw. mit pCU 065 (pSEC72∆TPR) und Membranen von einem Wildtyp wurden entweder mit 500 mM NaCl oder mit 100 mM Na2CO3, pH11 behandelt (3.2.2.4). Die Membranen wurden hochtourig sedimentiert und die Verteilung von Sec72p bzw. Sec72∆TPRp zwischen Membranen und Überstand durch eine Western Blot Analyse mit Antikörpern gegen Sec72p bestimmt (Abb. 17).
3 Ergebnisse 58
-M
M M M M M
S S S S S S
Wildtyp ∆sec72 pSec72
pH 11 pH 11 pH 11
∆sec72 pSec72∆TPR
- Sec72p - Sec72∆TPRp - X
500 mM NaCl
500 mM NaCl 500 mM
NaCl
Abb. 17: Untersuchung zur Lokalisierung von Sec72∆TPRp. Plasmide, die für SEC72 bzw. SEC72∆TPR kodieren wurden in den Stamm YUC 6 (∆sec72) transformiert. Transformanten sowie ein Wildtyp als Kontrolle wurden in Minimalmedium angezogen und geerntet, Membranen wurden nach einem Standardprotokoll präpariert und entweder mit 500 mM NaCl oder mit 100 mM Na2CO3, pH 11 für 20 min inkubiert. Die Membranen wurden sedimentiert und die Verteilung von Sec72p bzw. Sec72∆TPRp zwischen Membranen und Überstand durch eine Western Blot Analyse mit Antikörpern gegen Sec72p durchgeführt.
Wie Abb. 17 zu entnehmen ist, assoziiert Sec72∆TPRp unverändert Hochsalz-resistent und Alkali-beständig an Membranen. Der Funktionsverlust ist somit nicht auf eine Degradation oder falsche Lokalisierung zurückzuführen. Nach der Hochsalz- und Alkali-Resistenz zu urteilen, unterscheidet sich die Bindung von Sec72∆TPRp nicht von der des wt-Proteins.