NADPH-Oxidase-Aktivität und ROS-Produktion

Ein zentraler Bestandteil dieser Arbeit bestand in der Quantifizierung der Aktivität der NADPH-Oxidase. Dieses Enzym produziert – wie in der Einleitung dargelegt – Superoxidanionen, welche mäßig reaktive Sauerstoffverbindungen darstellen und aus denen weitere reaktivere ROS-Verbindungen entstehen können. Die direkte Messung von Superoxidanionen ist auf Grund deren kurzer biochemischer Halbwertszeit von 10^-4 s technisch mit der üblichen Laborausstattung nicht möglich. Daher erfolgte eine indirekte Messung über das Luminophor L-012, welches nach Reaktion mit ROS, und insbesondere mit Superoxid Lichtquanten emittiert. Allerdings ist die Bildung von Superoxid nicht NADPH-Oxidase-spezifisch. Eine weitgehende Spezifierung kann erzielt werden, indem man parallele Ansätze mit DPI, einem Inhibitor von FAD-haltigen Enzymen, behandelt. Der DPI-hemmbare Anteil bildet somit die Menge des von diesen Enzymen produzierten Superoxids ab. Der größte Anteil davon entfällt bei Leukozyten bzw. deren Subfraktionen auf die NADPH-Oxidase. Diese Messungen sollten in vier aus peripheren Blutleukozyten isolierten Zelltypen (T- und B-Lymphozyten, Monozyten/Makrophagen und NK-Zellen) und an lymphoblastoiden Zelllinien durchgeführt werden. Eine globalere Möglichkeit der Messung von ROS besteht in der fluorometrischen Analyse der Oxidation von DCFH-DA. Diese Reaktion weist insbesondere Wasserstoffperoxid nach.

4.1.1 NADPH-Oxidase-Aktivität in isolierten Leukozytenfraktionen

Zunächst sollte in T-Lymphozyten (CD3⁺), B-Lymphozyten (CD19⁺), Monozyten bzw. sich aus diesen differenzierenden Makrophagen (CD14⁺) und NK-Zellen (CD56⁺) von ca. 110 gesunden Spendern die PMA-stimulierbare Aktivität der NADPH-Oxidase quantitativ über Chemolumineszenz mit dem Substrat L-012 bestimmt werden. Dies erfolgte direkt im Anschluss an die durchflusszytometrische Sortierung in die vier Zell-Subpopulationen. Jede Population wurde mit PMA stimuliert und ein jeweils parallel mitgeführter Ansatz zusätzlich mit DPI behandelt. Die Häufigkeitsverteilungen für die vier Zelltypen sind als Differenz der Signale ohne und mit DPI in Abb. 4 illustriert.

Mit Ausnahme der CD14⁺-Zellen konnte erst nach dekadischem Logarithmieren der Messdaten eine Verteilung erzielt werden, die mit einer Normalverteilung vereinbar war.

Bezogen auf die CD3⁺-Zellen, war die Aktivität einer einzelnen Zelle bei den CD14⁺ etwa um Faktor 1000 und bei den CD19⁺ etwa um den Faktor 10 höher. Die CD56⁺ lagen gegenüber

den CD3⁺ im Mittel um etwa den Faktor 4 niedriger. Die inter- individuelle Streubreite war bei den CD19⁺ und den CD56⁺ höher als bei den CD3⁺ und CD14⁺.

Abb. 4 Verteilung der NADPH-Oxi dase-Akti vität in CD3, CD14, CD19 und CD56. Nac h Isolierung von PB MCs und Se parierung in die Subfr aktione n wur de in eine m Gesamtvol umen von 222 µl auf weißen 96-Well-Platten die Che molumi neszenz von L-012 bei 37°C über 90 min quantifiziert, wobei für die Aus wertung das in diesem Zeitraum auftretende Maxi mum ver we ndet wur de . Pro Well wur de n bei den CD3 und CD19 22000, bei de n CD14 2200 und bei den CD56 55000 Zellen eingesetzt und die dargestellten Akti vitäts werte beziehen sich auf je eine Zelle. Dabei wur de n pro Zelllinie zwei Ansätze, mit 10 ng/ml PMA bz w. mit 10 ng/ ml PMA und 10 µM DPI (je weils in Triplikaten), gemessen. Die Differenz aus bei den Ansätze n wur de als NADPH-Oxi dase-spezifischer Anteil der ge messenen Akti vität ge wertet. Deren Häufigkeitsverteilungen sind hier für 112 genetisch unterschiedliche Präpar ati onen von CD3, für 109 von CD14, für 114 von CD19 und für 105 von CD56 ver anschaulicht. Es wur de das Vorliegen einer Nor mal ver teilung gepr üft (Kol mog orov-S mirnov-Test), welche für die Rohdate n nur bei de n CD14 gegeben war. Nach Log arithmieren konnte näher ungsweise auch für die drei anderen Popul ati onen eine solche angenommen wer den (p > 0,05 nach Kol mogor ov-Smirnov). RLUs = relative light units, Einheit des Lumi neszenz-Signals.

Beim Vergleich der NADPH-Oxidase-Aktivität dieser Zelltypen zeigten sich die stärksten Leukoz yte n-Populatione n. In der Gr afik sind für 105 Zelllinien für die vier Zellfrakti onen die paar weisen Korrelatione n dargestellt und das je weilige Bestimmtheitsmaß r² CD56 der dekadische Logarithmus dieser Werte ver wende t, damit eine Nor mal ver teilung angenommen und eine par ametrische Analyse durchgeführt wer den konnte (siehe Abb. 4 S. 42, Versuchsbe dingungen entsprec hen den dor t genannten).

4.1.2 ROS in lymphoblastoiden Zelllinien

Zur Detektion von ROS in LCLs wurden mehrere Messverfahren ausgetestet. Hierbei erwiesen sich die Mikrotiterplatten-Verfahren (Lumineszenz mit L-012, Lucigenin und Luminol sowie Fluoreszenz mit Dihydroethidium) sämtlich als ungeeignet, da die Messsignale durch Reaktion mit FCS stark supprimiert werden. Die s gilt auch für die bei den Elektronenspinresonanz (ESR)-Messungen eingesetzten Spinprobes. Mit letzterem Verfahren konnte gezeigt werden, dass die bei FCS-Entzug gemessenen Signale unspezifisch und nicht durch die Oxidase-Aktivität bedingt sind (Parallelansätze mit und ohne NADPH-Oxidase-Inhibitor).

Weiterhin konnte in durchflusszytometrischen Messungen nachgewiesen werden, dass LCLs bei Fehlen von FCS bereits nach 15 min mit massiver unspezifischer ROS-Freisetzung reagieren und in einen präapoptotischen Zustand übergehen. Die hierbei ermittelte Schwellenkonzentration für eine nicht beeinträchtigte Vitalität liegt etwa bei 1,5 % FCS (v/v) für 4 h. Für o.g. Verfahren muss FCS jedoch deutlich < 1% sein. Daher musste das ursprüngliche Ziel der PMA-stimulierbaren Quantifizierung der NADPH-Oxidase-Aktivität in LCLs verlassen werden. Einzig Bestrahlungs- und Zytokin- induzierte Effekte auf die nicht

durch PMA stimulierte NADPH-Oxidase konnten nach 30 h Inkubationszeit durchflusszytometrisch mit DCFH-DA, welches hauptsächlich Wasserstoffperoxid nachweist, sinnvoll analysiert werden. Dieses Verfahren beruht auf intrazellulärer Aktivierung und Oxidation von DCFH-DA durch Wasserstoffperoxid und ist auch in Gegenwart von FCS durchführbar.