Neben zahlreichen anderen Anwendungsmöglichkeiten erlaubt die Durchflußzytometrie (flourescence activated cell sorting= FACS) eine Analyse von Zelloberflächenmolekülen. Die Messungen verlaufen voll automatisiert mit Hilfe eines FACSsort™ Gerätes. Stark vereinfacht werden Zellen einer vorbereiteten Probe über einen, durch Druckluft erzeugten, Flüssigkeits-Hüllstrom in Messungskanülen eingesaugt (Hydrodynamische Fokussierung). Intern verjüngt sich die Kanüle von 80 auf 20-40µm, so dass die Zellen im Flüssigkeitsstrom nacheinander einzeln eine Lichtquelle passieren. Diese wird von einer Argon-Laser erzeugt, der monochromatisches Licht der Wellenlänge 488nm emittiert. Dadurch wird der Fluoreszenzfarbstoff, der zur Färbung der Zellen verwendet wurde, angeregt und emittiert seinerseits Licht das dann von diversen Fotodioden aufgezeichnet und amplifiziert wird. Die Zelle selbst erzeugt eine Autofluoreszenz bzw.
Lichtbeugung und -streuung, durch die Aussagen über die Größe (FSC=Forwardscatter) und Granularität bzw. innere Struktur der Zellen (SSC=Sidescatter) möglich ist. Ein Softwareprogramm (Cellquest™) dokumentiert jede einzelne Zelle. Eine statistisch aussagekräftige Anzahl an Zellen (mind. 10.000) ermöglicht eine qualitative und quantitative Aussage über die untersuchten Moleküle.
Die Methode wurde hier verwendet, um die Bindung von HPV11-L1 VLPs an K562 Zellen zu untersuchen. Dadurch war die Identifizierung von Substanzen mit einer inhibitorischen Funktion bezüglich der Bindung von VLPs an K562 Zellen möglich. Die Etablierung des Experimentes ist in Abschnitt 4.4.2.2. dokumentiert. Für jede Probe wurden 3x105K562 Zellen, resuspendiert in 500µl Kulturmedium, in 1,5ml-Reaktionsgefäße pipettiert. Zur Sättigung zellulärer HPV-Rezeptoren wurden 15µg HPV11-L1 VLPs benötigt. Die Bindung von VLPs erfolgte 45min auf Eis,
* Kalkulation von Bindungsepitopen siehe Abschnitt 3.7.6.
Zellzahl/Meßprobe Zur Sättigung benötigte Menge an HPV11-VLPs Anzahl möglicher Bindungsepitope pro Kapsid*
Art der VLP-Detektion Sensitivität
VLP-Festphasen Zellbindungsassay 2x104pro well
200ng
2x1012
Nachweis zellgebundener VLPs durch Substratumsetzung des Peroxidase-gekoppelten Sekundär-Antikörpers
Inhibitorische Eigenschaften von Molekülen sind aufgrund der Farbreaktion nur tendenziell abschätzbar
Durchfluß-Zytometrie 3x105pro Meßprobe 15µg
1,62x1014
Nachweis zellgebundener VLPs durch FITC-gekoppelten Sekundär-Antikörper
Sensitivität ist hoch, da jede Zelle einzeln analysiert werden kann VERGLEICH VON ZELLBINDUNGSASSAYS FÜR DIE UNTERSUCHUNG VON HPV11-SPEZIFISCHEN PHAGEN BZW.
PEPTIDEN HINSICHTLICH INHIBITION DER VLP-BINDUNG AN ZELLEN Tabelle 3.2
ungebundene VLPs wurden durch Waschen entfernt. Dazu wurden die Zellen sedimentiert (je 2min, 4°C und 2000rpm in einer Eppendorf-Tischzentrifuge 5417R) und nach Absaugen des ÜS in 1,5ml RMPI-Medium resuspendiert, dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt.
Die Proben wurde anschließend in 200µl Antikörperlösung resuspendiert und für 45min auf Eis gehalten. Der HPV11-spezifische monoklonale AK B2 wurde 1:500 (ca. 20µg/Probe) in RMPI-Medium verdünnt, um zellgebundene VLPs zu detektieren. Nach Entfernung des überschüssigen Antikörpers wurden die Proben in 200µl einer Sekundärantikörper Lösung resuspendiert und nochmals 45min auf Eis inkubiert. Dafür wurde ein FITC-gekoppeltes, Ziege αMaus-IgG-Fab Fragment 1:100 verdünnt (entspricht etwa 3µg AK pro Probe). Schließlich wurden die Proben wie beschrieben 3x in PBS gewaschen, um auch Farbreste des Mediums zu entfernen. Die vorbereiteten Proben wurden in je 300µl PBS aufgenommen und sofort vermessen. Alternativ wurden die Zellen mit PBS/0,1% Formaldehyd fixiert und am folgenden Tag vermessen. Die Vermessung mit dem FACSsort Gerät erfolgte mit dem Programm Cellquest.
3.7.5. Theoretische Kalkulation potentieller Bindungsepitope auf HPV11-L1 VLPs
1VLP ≅360 L1-Monomere in 72 Kapsomeren L1 ≅55kDa x 360 = 19.800kDa
1 kDa = 1,66x10-21g
19.800 kDa = 3,3x10-17g = 1VLP = 3,3x10-8ng 1ng ≅ 3,03x107VLPs
Molare Verhältnisse beim VLP-Festphasen-Zellbindungsassay:
200ng VLPs ≅6x109VLPs
bei max. 360 Epitopen würden sich also maximal ca. 2x1012Bindungsepitope ergeben.
Phagen präsentieren das rekombinante Peptid 3-5 mal innerhalb des Schwanzproteins pIII Als produzierbare Menge erwies sich max. 5x1011Phagen/200ng VLPs
Dies entspricht annähernd einem molaren Ratio von 1:1.
Molare Verhältnisse des VLP-Bindungsassay analysiert per Durchfluß-Zytometrie:
15µg VLPs pro Probe ≅ 4,5x1011VLPs x 360
= 1,62x1014max. Anzahl an Peptidbindestellen
100-fach molarer Überschuß an Peptid am Bsp. von PD15:
MW PD15 = 1085 Da
1Mol = 1085g
1mg = 921 nMol (annähernd 1µMol) 1Mol = 6x1023Teilchen
1µMol = 6x1017T.
Peptidlösung [1mg/ml]: 20µl ≅ ca. 2x1016Teilchen
dies entspricht einem 100-fach molaren Überschuß an Peptid bezogen auf die max. mögliche Anzahl von Epitopen auf 15µg HPV11-VLPs.
3.8. Arbeiten mit Peptiden
Die Durchführung von HPLC und Massenspektroskopie wurde mit Hilfe der AG Ruppert, ZMBH vorgenommen. Peptide einer ersten Order, die ohne HPLC-Profile geliefert wurden, wurden zunächst per analytischer HPLC charakterisiert. Dabei stellte sich heraus, dass die Peptide extrem verunreinigt waren. Einige dieser Peptide konnten mittels quantitativer HPLC aufgereinigt und anschließend oxidiert werden. Die anderen Peptide wurden verworfen und neu synthetisiert. Die Synthese wurden von erfahrenen Peptidsynthese-Einheiten vorgenommen (2.9).
3.8.1. Analytische und präparative HPLC (high performance liquid chromatography)
Peptide werden mit Hilfe der „Reversed-phase“ Chromatographie aufgereinigt. Bei dieser Art der Chromatographie ist die stationäre Phase aus einem Silikarückgrat aufgebaut, an das aromatische-und Alkylreste unterschiedlicher Länge kovalent gebaromatische-unden sind. Die Adsorption des gelösten Peptids (mobile Phase) erfolgt über hydrophobe Interaktion mit der stationären Phase. Durch kontinuierliche Erhöhung der Konzentration an hydrophobem Lösungsmittel (Acetonitril) in der mobilen Phase erfolgt anschließend die Desorption des Peptids gemäß seiner hydrophoben Eigenschaften, es wird dadurch von Verunreiniungen getrennt.
Die HPLC erfolgte vollautomatisiert, das Peptid wurde in H20, bei hydrophoberen Peptiden mit Acetonitril-Anteil, gelöst und dann automatisch in die Säule gepumpt. Für die Analyse reichten Peptidmengen im Nanogramm-Bereich in 100µl Volumen aus.
Für die Aufreinigung per präparativer HPLC wurde die gesamte Probe auf die Säule geladen, das Eluat wurde in 1ml Fraktionen gesammelt und die dem Peptid entsprechenden Fraktionen wurden gepoolt. Nach Entfernen des Lösungsmittels durch Lyophyllisierung wurde das Peptid in einem geeigneten Volumen gelöst und oxidiert.
3.8.2. Oxidation von Cystein-flankierten Peptiden
Die Peptide sollten über die endständigen Cysteine unter Ausbildung einer Disulfidbrücke oxidiert und damit zyklisiert werden. Zuerst wurde das Peptid in H20 und, je nach polaren Eigenschaften, durch Zugabe von etwas Acetonitril in großem Volumen (ca. 1-5 µMol/ml) in einem Glasgefäß gelöst. Ein hohes Volumen begünstigt die Ausbildung intrazellulärer Disulfidbrücken und vermeidet
ungewünschte Dimere/Polymere. Die Peptidlösung wurde mit reinem Ammoniak auf einen pH = 8.0-8.5 eingestellt. Im basischen Milieu dissoziieren Protonen von den Sulhydrilgruppen, dadurch wird der Schwefel reaktiver. Mit Hilfe einer Pasteurpipette wurde gasförmiger Sauerstoff in die Lösung eingeblasen, der Verlauf der Oxidation wurde durch Kontrolle des pH beobachtet, der durch Freisetzung der Protonen ansteigt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Lösungs-mittel durch Lyophyllisierung der Peptidlösung entfernt. Die Oxidation wurde über Massenspektro-skopie kontrolliert.
Oxidierte Peptide wurden schließlich mit einer Konzentration von 1mg/ml in H20 oder einem Gemisch mit minimal nötigen Acetonitrilanteil gelöst.
3.8.3. Massenspektrokopie
Die Bestimmung des Molekulargewichts von Peptiden mittels Elektrospray-Ionenfallen-Massen-spektroskopie wurde von A. Bosserhoff, ZMBH durchgeführt.
Stark vereinfacht werden die Peptidmoleküle in flüchtigem Lösungsmittel durch Energiezufuhr so fein verteilt, dass sie als Einzelmoleküle gemäß ihrer Ionenladung detektiert werden können. Das Spektrogramm eines Peptids zeigt eine Serie von Ionensignalen, die sich durch unterschiedliche Verhältnisse von 13C und 14C in einzelnen Molekülen unterscheiden (Isotopenmuster; Vgl. Abb. 4.20) Es handelt sich um ein Peptidmolekül, nicht um verschiedene Oxidationsstadien.
4. Ergebnisse
4.1. Screening einer Random-Peptidbibliothek mit dem Hefe-Two-Hybrid-System (THS)*
4.1.1. Prinzip des Systems und Verwendung
Das THS-System basiert auf der modularen Natur eukaryotischer Transkriptionsfaktoren (TF). Der bei diesem Screening eingesetzte Hefe-Transkriptionsfaktor GAL4 besteht aus den voneinander separierbaren DNA-Binde- (DB) und Transaktivierungsdomänen (AD). DB erkennt den Promotor des zu aktivierenden Gens und bindet dort, die Anlagerung des Transkriptions-Initiationskomplex-es erfolgt über AD. Um nun eine Protein-Protein Interaktion mit Hilfe dTranskriptions-Initiationskomplex-es THS zu identifizieren, werden die zu untersuchenden Proteine bzw. Peptide, unter Ausbildung von Hybridproteinen an jeweils eine der hier getrennt vorliegenden TF-Domänen fusioniert. Eine positive, spezifische Pro-tein/Protein-Interaktion kann durch die Expression von Reportergenen detektiert werden. Die Aktivierung der Reportergene erfolgt nur dann, wenn die Zusammenlagerung der beiden Domänen des Transkriptionsfaktors durch die spezifische Interaktion ihrer fusionierten Hybridproteine vermittelt wird (siehe Abb. 4.1). Die Aktivierung der Reportergene HIS und ADE ermöglicht Hefe-klonen das Wachstum auf Minimalnährböden, denen kein Histidin und Adenin zugesetzt wurde.
Wachstumsfähige Klone enthalten daher potentielle Interaktionspartner des Proteins von Interesse und können leicht isoliert werden. Besonderheiten der in dieser Arbeit angewendeten THS-Methode sind die synchrone, duale Reportergenselektion zur Erhöhung der Selektionsstringenz so-wie der effizientere Weg der Vereinigung beider TF-Hybridkonstrukte durch Hefepaarung (Mating).
Das Hefe Two-Hybrid-System wurde im Rahmen dieser Dissertation verwendet, um eine 16mer Random-Peptidbibliothek mit dem Hauptstrukturprotein L1 des Humanen Papillomavirus Typ16 (HPV16) hinsichtlich spezifisch interagierender Peptide zu durchsuchen (siehe Abschnitt 1.9).
Anschließend sollte auch HPV11-L1 auf diese Art untersucht werden.
*Erklärung verwendeter englischer Fachbegriffe siehe Anhang Abb. 4.1 ERLÄUTERUNG DER VORGÄNGE BEIM HEFE TWO-HYBRID-SYSTEM.
Die spezifische Interaktion zwischen einem Ziel-protein (L1) und einem Peptid (Pep) vermittelt die Funktionalität von DNA-Bindedomäne (fusioniert an L1) und Transaktivierungsdomäne (fusioniert an das Bibliothekspeptid), als Transkriptionsfaktor die Expression des Reportergens zu aktivieren.