Nachweis der retroviralen Expression der GFP-TAK1- GFP-TAK1-Fusionsproteinein stabil infizierten NIH-3T3-Zelllinien

Durch Untersuchungen in den stabil infizierten Zelllinien sollen Aufschlüsse darüber gewonnen werden, in welche cytokin-induzierten Signalwege TAK1 involviert ist, und inwieweit es für die Expression von entzündungsrelevanten Genen wichtig ist. Der An-satz beruht darauf, dass die überexprimierte katalytisch inaktive Mutante einen domi-nant negativen Effekt ausübt; sie verdrängt die Funktion von endogenem TAK1. Eine starke Überexpression der Fusionsproteine ist deswegen eine Grundvoraussetzung da-für, dass die Zelllinien ein geeignetes Untersuchungsmodell darstellen.

Die Expression der GFP-TAK1-Fusionsproteine in den stabil infizierten Zelllinien wur-de zunächst im Western-Blot überprüft. Abbildung 7 zeigt ein exemplarisches Ergebnis.

Das Ergebnis ist vergleichbar mit dem Ergebnis aus den Verpackungslinien. Sowohl die Wildtyp-Zelllinie als auch die Zelllinie mit der Mutante zeigen eine sehr starke Überex-pression der Fusionsproteine, wobei die ExÜberex-pression in der GFP-TAK1K63W-Linie deut-lich stärker ist als in der Wildtyplinie. In beiden Zelllinien treten verkürzte Fragmente der Fusionsproteine auf. Auch hier ist die Überexpression im Vergleich zur Expression des endogenen Proteines sehr hoch. Ob die Fragmente schon in der Zelle auftreten oder es sich um ein Artefakt bei der Herstellung der Lysate handelt, konnte nicht endgültig geklärt werden, jedoch ist eine proteolytische Aktivität in den Lysaten aufgrund der Verwendung von Standard-Proteinaseinhibitoren und Durchführung der Arbeiten in der Kälte unwahrscheinlich. Eine alternative, spekulative Erklärung ist, dass es infolge der massiven Überexpression aufgrund der starken LTR-Promoteraktivität (siehe auch mRNA-Ergebnisse) der Translationsapparat der NIH3T3-Zellen für diese Transkripte

„gesättigt“ wird und es zu unvollständig translatierten GFP-TAK1-Proteinprodukten kommt.

Die Überexpression der Fusionsproteine war über den gesamten Zeitraum der folgenden Untersuchungen in diesen Linien stabil, was durch regelmässige Überprüfungen im Westernblot kontrolliert wurde.

Abb.7: Nachweis der Expression von GFP-TAK1 und GFP-TAK1K63W in den stabil infizierten NIH3T3-Linien

Durch retrovirale Infektion stabil GFP-TAK1wt oder GFP-TAK1K63W überexprimie-rende Zelllinien oder eine mit Leervirus infizierte Kontrolllinie wurden nach der Vor-schrift zur Herstellung von Lysaten zur IP von JNK hergestellt. 100µg Protein wurden im Western-Blot auf Expression von GFP-TAK1wt und GFP-TAK1K63W mit GFP- und TAK1- spezifischen Antikörpern untersucht. GFP-TAK1 wird oberhalb des 97 kDa- Markers detektiert, endogenes TAK1 oberhalb des 66 kDa Markers.

Die Expression wurde ebenfalls auf RNA-Ebene im Northernblot untersucht. Die retro-virale RNA wurde mit einer Sonde gegen die LTR, in deren Bereich der Promotor der retroviralen Kassette liegt, detektiert. Das Ergebnis ist in Abbildung 8 zu sehen.

Die LTR-Sonde detektiert spezifisch in den infizierten Zellen retrovirale RNA, wie der Vergleich mit RNA aus nicht infizierten NIH3T3-Zellen zeigt. In der Kontrolllinie, die mit „leerem“ Virus infiziert wurde, ist nur ein starkes Signal zu erkennen, das auf der Höhe zwischen der 18S-(1874 Basen) und der 28S-(4718 Basen) rRNA läuft und damit der erwarteten Größe der viralen RNA entspricht (ca. 3,7 kb)

In der GFP-TAK1wt-Zelllinie und in der GFP-TAK1K63W-Zelllinie werden jeweils zwei Transkripte detektiert, eines oberhalb der 28S-RNA und eines zwischen der 18S- und der 28S-RNA, auf der gleichen Höhe wie das Transkript des Leerviruses. Das größere der beiden Transkripte entspricht der erwarteten Größe der bicistronischen retroviralen RNA (ca 6,2 kb). Die Expression der RNA mit der GFP-TAK1wt-codierenden Sequenz ist dabei deutlich schwächer als die der RNA mit der GFP-TAK1K63W-codierenden Se-quenz, was auch das Ergebnis aus der Western-Blot Untersuchung bestätigt, in der eine schwächere Expression des GFP-TAK1wt-Proteins zu erkennen ist.

Das kleinere der beiden Transkripte macht in der GFP-TAK1wt-Zelllinie den größeren Teil und in der GFP-TAK1K63W-Zelllinie den geringeren Anteil der detektierten Transkripte aus. Ob dieses kleinere Transkript eine „Splicing“-Variante der retroviralen RNA ist, wurde nicht näher untersucht.

Abb. 8: Nachweis der retroviralen mRNAs in den stabil infizierten Zelllinien

Aus den stabil infizierten Zelllinien und aus der NIH3T3-Mutterzelllinie wurde Ge-samt-RNA isoliert und 15 µg davon in einem 1,2 %igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und im Northern-Blot Verfahren auf eine Hybond^TM-Membran transferiert.

Die von den LTR aus exprimierte retrovirale mRNA wurde mit einer radioaktiv mar-kierten cDNA-Sonde gegen die LTR detektiert. Die gleichmäßige Beladung wurde mit einer radioaktiven cDNA-Sonde gegen die gapdh-mRNA überprüft.

NIH 3T3 Kontrolllinie

GFP-TAK1wt GFP

-TAK1^K63W

LTR-GFP-TAK1 mRNA

LTR-mRNA + unspez. Bande

NIH 3T3 Kontrolllinie

GFP-TAK1wt GFP

-TAK1^K63W

LTR-GFP-TAK1 mRNA

LTR-mRNA + unspez. Bande

Da die einzelnen Zelllinien nicht durch Einzelzellklonierung etabliert wurden, sondern bezüglich des chromosomalen Integrationsortes und der Expressionsstärke eine Misch-kultur darstellen, stellte sich die Frage nach der Homogenität der Expressio innerhalb der Zelllinien.

Daher erfolgte die Untersuchung der Expression auch auf Einzelzellebene anhand der Grünfluoreszenz des GFP-Fusionsanteils der TAK1-Proteine.

Abbildung 9 zeigt das Ergebnis der Untersuchungen: die Überexpression der GFP-TAK1-Proteine ist in beiden Zelllinien sehr stark, wobei die Intensität der Grün-fluoreszenz in der Zelllinie mit der katalytische inaktiven Mutante stärker ist als in der Wildtyp-Zelllinie. Dies stimmt mit den Expressionsdaten aus den Western-Blot Unter-suchungen überein. In der Abbildung werden die Unterschiede durch unterschiedliche Integrationszeiten bei der Bildaufnahme und die anschließende graphische

Nachberei-Phasenkontrast

Grünfluoreszenz

Kontrolllinie

GFP-TAK1wt

GFP

-TAK1^K63W Phasenkontrast

Grünfluoreszenz Phasenkontrast

Grünfluoreszenz

Kontrolllinie

GFP-TAK1wt

GFP

-TAK1^K63W

Abb.9: Nachweis der Grünfluoreszenz der überexprimierten

GFP-TAK1 Fusionsproteine in den stabil infizierten Zelllinien

1 x 10⁵ Zellen der jeweiligen Zelllinien wurden in einem Loch einer 6-Lochplatte ausgesät und über Nacht kultiviert. Dann wurden die Zellen einmal mit 1ml PBS gewaschen und mit 1 ml PBS bedeckt. Die Aufnahmen der Zellen wurden an dem Mikroskop Axiovert 200,Carl-Zeis Jena mit 40facher Vergrößerung gemacht. Zur Aufnahme der Zellen im Phasenkontrast wurde die Einstellung PC1 gewählt. Die Aufnahmen zur Detektion der Grünfluoreszenz des GFP-Fusionsanteils wurde das Filterset 09 verwendet.

tung der Daten etwas verringert. In beiden Zelllinie ist zu erkennen, dass die Fusions-proteine hauptsächlich cytosolisch lokalisiert sind, wobei eine Lokalisation im Zellkern bei dieser Art der mikroskopischen Aufnahme nicht ausgeschlossen werden kann. Je-doch heben sich zumindest in der GFP-TAK1K63W-Zelllinie die Zellkerne deutlich vom Rest des Zellkörpers ab.

Die zu beobachtenden Intensitätsunterschiede der Grünfluoreszenz innerhalb der Zellli-nien sind sehr gering, und Zellen, die eine stark abweichende Fluoreszenzintensität ha-ben, zeigen auch in der Phasenkontrastaufnahme eine entsprechende Abweichung. Die Expression der Fusionsproteine ist innerhalb der Zelllinien also sehr gleichmäßig, was eine sehr wichtige Vorraussetzung für die geplanten biochemischen Untersuchungen ist.

4.6 Hemmung der IL-1- und TNF-stimulierten JNK und p38 Aktivität