Nachweis des trimeren Makrokomplexes in Thrombozyten

Als Erstes wurde die Expression verschiedener Proteine in den Thrombozyten von WT-, IRAG-KO- und IRAG∆12-Mäusen untersucht. Im Western Blot wurden dazu beide cGKI-Isoformen, der InsP₃R-I, IRAG, das Vasodilatator-stimulierte Phosphoprotein (VASP) und die Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) detektiert. GAPDH ist wie

β-Aktin eines der sog. „Housekeeping“-Proteine, welche unabhängig von Zelltyp und Zellstadium exprimiert werden und deren Proteinmenge häufig als interne Ladungskontrolle in einem Western Blot betrachtet wird. Dabei zeigte sich, dass der InsP3R-I in WT-, IRAG-KO- und auch in IRAG∆12-Thrombozyten in etwa gleichem Ausmaß vorhanden ist (s. Abb. 10). Was die cGKI betrifft, so war die Expression von cGKIβ im IRAG-KO sehr stark reduziert, aber in den IRAG∆12-Thrombozyten etwa gleich wie im Wildtyp. Im IRAG-KO war eine sehr schwache cGKIβ-Bande erst nach langer Belichtung des Chemolumineszenzfilms zu sehen (Daten nicht gezeigt). Die Expression von cGKIα war im Wildtyp und in den IRAG∆12-Thrombozyten gleich, während im IRAG-KO eine leichte Hochregulation, das heißt eine größere Proteinmenge, zu beobachten war. Das Vasodilatator-stimulierte Phosphoprotein (VASP), dessen Phosphorylierung zur Kontrolle der cGKI-Aktivität in den Phosphorylierungsexperimenten untersucht wurde, war in allen drei Fällen in gleicher Menge vorhanden, wenn die Proteinmenge auf den Gehalt an GAPDH bezogen wurde. Der IRAG-AK zeigte eine Kreuzreaktivität und detektierte im Western Blot im IRAG-KO und in der IRAG∆12-Probe knapp über der IRAG-Bande ein zusätzliches Protein. Diese unspezifische Bande wurde im WT vermutlich von der eigentlichen IRAG-Bande überlagert.

Abb. 10: Expression diverser Proteine in WT-, IRAG-KO- und IRAG∆12-Thrombozyten

Es wurden je 60 µg Gesamtprotein auf ein 11,5%-Polyacrylamidgel aufgetragen. Der Western Blot wurde mit den jeweiligen primären AK gegen InsP3R-I, IRAG, cGKIβ, cGKIα, VASP und GAPDH inkubiert.

Als Nächstes wurde das Vorliegen des trimeren Komplexes in den Mausthrombozyten nachgewiesen. Dafür wurden als Erstes cGMP-Agarosefällungen mit WT- und IRAG-KO-Thrombozyten durchgeführt. Bei den WT-IRAG-KO-Thrombozyten konnten sowohl cGKIα als auch cGKIβ gefällt werden, da die Kinasen cGMP binden. Zusätzlich wurden die mit der cGKIβ

interagierenden Proteine IRAG und InsP₃R-I nachgewiesen (s. Abb 11). Im IRAG-KO dagegen konnte neben cGKIα nur sehr wenig cGKIβ detektiert werden, aber kein

InsP₃R-I, da im IRAG-KO das Ankerprotein (IRAG) für diesen Calciumkanal fehlt (s.

trimerer Komplex Abb. 3). Zur Kontrolle der unspezifischen Bindung - womit die Bindung von Proteinen an die Agarose direkt oder an den Linker gemeint ist (Hanke et al., 2011) - wurde WT-Thrombozytenlysat mit Ethanolaminagarose inkubiert. Diese ist das Pendant zur üblicherweise verwendeten 8-AET-cGMP-Agarose (8-Aminoethylthio-cGMP-Agarose), deren Linker ebenfalls aus einem Ethylrest besteht. Bei Ethanolaminagarose fehlt lediglich das zyklische Nukleosidmonophosphat zur Kinasebindung. Hierbei zeigte sich, dass unter den gewählten Versuchsbedingungen (Bindungspuffer mit 150 mM NaCl und 2 % Lubrol als Detergens, Proteinbindung über Nacht und drei Waschschritte vor der Elution) keine unspezifische Bindung auftrat.

Abb. 11: Der trimere Komplex in Thrombozyten: cGMP-Agarose

cGMP-Agarosefällungen mit WT- und IRAG-KO-Thrombozyten (je 250 µg Gesamtprotein). Als Kontrolle der unspezifischen Proteinbindung an Agarose wurden WT-Thrombozyten mit Ethanolaminagarose inkubiert. Im Western Blot wurden der InsP3R-I, IRAG, cGKIβ und cGKIα detektiert.

Da mit cGMP-Agarose alle cGMP-bindenden Proteine, unter anderem auch Phosphodiesterasen, angereichert werden können, wurden zum Nachweis des trimeren Komplexes anschließend die spezifischeren Co-Immunpräzipitationen mit Protein A-Sepharose durchgeführt. Sowohl bei Verwendung von cGKIβ-, als auch von anti-IRAG- und anti-InsP₃R-I-AK konnten im Wildtyp alle drei Proteine im Präzipitat detektiert werden. Mit anti-cGKIα-AK jedoch konnte keines der Komplexproteine gefällt werden (s. Abb. 12 A). Das heißt, dass unter den gewählten Bedingungen (siehe cGMP-Agarosefällung) die cGKIα nicht im Komplex vorlag und auch nicht unspezifisch an die

Sepharose-Matrix gebunden wurde. Zum Nachweis eventueller durch den Antikörper selbst hervorgerufener Banden wurde ein Versuch nur mit anti-IRAG-AK plus Protein A-Sepharose ohne Zugabe von Protein durchgeführt. In diesem Fall konnte im Western Blot nur die „heavy chain“ des Antikörpers detektiert werden, jedoch waren keine Banden auf Höhe der anderen Proteine zu sehen. Gemeinsam mit der cGKIα-Probe kann daraus gefolgert werden, dass die Bindung der drei Komplexproteine untereinander sehr spezifisch erfolgt. In den IRAG-KO-Thrombozyten dagegen konnte wie schon in der cGMP-Agarosefällung keine Interaktion zwischen InsP3R-I und cGKIβ ohne Vorhandensein des IRAG-Proteins nachgewiesen werden (s. Abb 12 B). Bei der mit dem anti-InsP3R-I-AK in der cGKIα- und der cGKIβ-Immunpräzipitation detektierten Bande muss es sich um eine Kreuzreaktivität handeln, da das detektierte Protein ein etwas kleineres apparentes Molekulargewicht hat als das InsP₃R-I-Protein im Ausgangslysat.

Das mit dem anti-IRAG-AK detektierte Protein im Knock-out wurde bereits auf Seite 54 beschrieben und kommt ebenfalls durch eine Kreuzreaktivität dieses Antikörpers zustande. Interessanterweise wurde dieses Protein mit den eingesetzten Antikörpern co-immunopräzipitiert.

Abb. 12: Nachweis des trimeren Komplexes in Thrombozyten: Co-Immunpräzipitationen A) Protein A-Sepharosefällungen mit anti-IRAG-, anti-InsP3R-I- und anti-cGKIα/β-AK mit WT-Thrombozytenlysat (je 250 µg Protein). Eine Probe mit anti-IRAG-AK ohne Protein zur Detektion unspezifischer, durch den Antikörper selbst verursachter Banden. Mit dem anti-cGKIβ-AK wurde im Western Blot zusätzlich die „heavy chain“ des zur Immunpräzipitation eingesetzten AK detektiert. B) Co-Immunpräzipitationen mit IRAG-KO-Thrombozytenlysat (je 250 µg) mit anti-cGKIβ-, anti-InsP3R-I- und anti-cGKIα-AK. Im Immunblot wurden der InsP3R-I, IRAG und cGKIα/β detektiert.