2. Material und Methoden
2.7. Nährstoffanalyse
Die Wasserproben wurden kurz vor der Nährstoffanalyse aufgetaut und mit einer automatisierten analytisch-chemischen Methode (continuous flow analysis, CFA) auf ihren Ammonium-, Nitrat-, Nitrit und Phosphatgehalt hin untersucht. Die Bestimmung mit dem Autoanalyser erfolgte gemäß den vom Hersteller angegebenen Methoden-vorschriften (Bran + Luebbe-AutoAnalyzer-3 AA3, Bran + Luebbe GmbH, Norderstedt). Der Bran + Luebbe-AutoAnalyzer-3 ist ein nass-chemisches Analyse-Gerät zur automatischen Bestimmung komplexer chemischer Reaktionen. Das System nutzt das Prinzip der luftsegmentierten kontinuierlichen Durchflussanalyse zur vollautomatischen Probenbestimmung.
Die Proben werden in einem kontinuierlichen Durchfluss mit den Reagenzien vermischt, wobei die einzelnen Probensegmente durch Luftblasen getrennt bleiben.
Das Analysesystem besteht aus mehreren nacheinander geschalteten einzelnen Modulen. Die Steuerung der gesamten Analyseeinheit funktioniert über einen angeschlossenen Computer.
Der Autoanalyser besteht zuerst aus einem software-gesteuerten Probennehmer und einer Peristaltikpumpe, die die Proben, Luft und Reagenzien durch das ganze Analysesystem befördert. Durch den Schlauchdurchmesser werden die jeweiligen Durchflussraten der Reagenzien und der Probe eingestellt, die in der Methode definierten sind. Zudem lässt sich der Arbeitsbereich durch veränderte Schlauch-durchmesser und die Detektorverstärkung verändern. An die Pumpe ist die analytische Einheit angeschlossen, die mit Mischspiralen, Heizbädern, und im Falle des Nitratkanals mit einer Cadmium-Reduktionssäule versehen ist.
Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, wird die Proben-/Reagenz-/Luftmischung aus der analytischen Einheit zur colorimetrischen Analyse in das Digitalcolorimeter geleitet. Das Digitalcolorimeter enthält je Kanal ein Durchflussphotometer, das die Probenkonzentration spektrophotometrisch bestimmt. Die Dicke der Durchfluss-küvette beträgt 10 mm. Die Färbung der Flüssigkeit ruft eine Reduktion der Lichtintensität hervor. Eine gleichzeitig mit der Probenmessung stattfindende Messung eines Referenzlichtstrahls kompensiert Veränderungen der Lampenintensität, der Temperatur und der Stromspannung. Die Konzentration wird indirekt bestimmt, indem nicht die optische Extinktion des Probe-/Reagenzstroms sondern die Änderung der Stromspannung an einem Photodetektor gemessen und mit Standards bekannter Konzentrationen verglichen wird.
Durch die Segmentierung mit Luftblasen ist eine Vermischung und eine Verschleppung zwischen den Proben reduziert, so dass eine hohe Analyserate von bis zu 60 Proben pro Stunde möglich ist. Die chemische Methode, die bei der CFA angewandt wird, orientiert sich mit nur geringfügigen Unterschieden an der manuellen Methode (Hansen & Koroleff 1999). Die Änderungen sind durch das automatisierte System bedingt und den jeweiligen Methodenvorschriften zu entnehmen. Der Vorteil ergibt sich vor allem aus dem vollständigen Ablauf der chemischen Reaktionen ohne Zeitfaktor, der bei chemischen Reaktionen ansonsten eine Rolle spielt. Die Methoden sind gemäß EPA, AOAC, ISO, DIN und anderen staatlichen Untersuchungsrichtlinien anerkannt.
Bei den Angaben zur Verlässlichkeit des Analysesystems muss erstens der hohe Probenumfang, zweitens der große Messbereich und drittens eine 1:10 Proben-verdünnung berücksichtigt werden. Die tatsächliche Messgenauigkeit wurde bestimmt, indem eine Probe mit unbekannten Konzentrationen der vier Nährstoffe zehnmal gemessen wurde. Die Standardabweichung vom Mittelwert dieser Messungen wird als Messgenauigkeit bzw. Sensitivität angegeben.
2.7.1. Nachweisverfahren Ammonium
Die Sensitivität der Autoanalyser-Methode (Methode MT19 G-171-96 Rev.7), der die Berthelot-Reaktion zu Grunde liegt, beträgt zwischen 0,06 und 0,17 µmol/L bei einer Probenkonzentration von 0-300 µmol/L Ammonium (Hansen & Koroleff 1999). Die während der Messungen ermittelte Messgenauigkeit, bzw. Sensitivität betrug ±0,108 µmol/L (n=10). Ammonium reagiert in alkalischer Lösung mit Hypochlorid zu einem Monochloramin. Als Donator der Hypochlorid-Ionen wird das Dihydrat des Natrium-salzes der Dichloroisocyanursäure (DCI) verwendet, weil Hypochlorid-Ionen durch die hydrolytische Spaltung des Dichlorisocyanurats entstehen. Das Monochloramin reagiert in Gegenwart von Salicylat-Ionen und Hypochlorid-Ionen im Überschuss sowie in Gegenwart von Nitroprussidnatrium als Katalysator zu dem blaugrünen Komplex Indophenolblau. Zusätzlich wird die Sensitivität durch Zugabe der katalytisch wirkenden Nitroprussid-Ionen erhöht.
Die Zugabe des Komplexreagenz, welches Ethylendiamintetraessigsäure enthält, verhindert die Präzipitation von Hydroxiden mit zweiwertigen Metall- und Erdalkali-Ionen (Ca2+
, Mg2+
) und hält diese in Lösung. Zweiwertige Ionen hätten einen störenden Einfluss auf die Sensitivität. Die maximale Extinktion wird bei E660 nm gemessen.
Mit dem verwendeten Brij-35® Reagenz (Bran + Luebbe GmbH, Norderstedt), einem Netzmittel, wird die Fließeigenschaft des Reagenziengemischs in den feinen Schlauchsystemen des Analysesystems verbessert.
Komplexreagenz
EDTA C10H14N2O8 * 2 H2O 30 g
tri-Natrium Citrat Dihydrat C6H5Na3O7 * 2 H2O 120 g Nitroprussid Natrium Na2[Fe(CN)5NO] * 2 H2O 0,5 g
Aquademin. 1000 mL
Brij-35® 3 mL
DCI Lösung
DCI C3Cl2N3NaO3 * 2 H2O, 0,2 g
Natriumhydroxid NaOH 3,5 g
Aquademin. 100 mL
Salicylatreagenz
Natrium Salicylat C7H5NaO3 300 g
Aquademin. 1000 mL
2.7.2. Nachweisverfahren Nitrit
Die Sensitivität der Autoanalyser-Methode (Methode MT18 G-173-96 Rev.5) beträgt zwischen 0,07 und 0,09 µmol/L bei einer Probenkonzentration von 2-25 µmol/L Nitrit (Hansen & Koroleff 1999). Die während der Messungen ermittelte Sensitivität betrug
±0,003 µmol/L (n=10). Nitrit-Ionen reagieren unter Diazotierung in saurer Lösung mit der Aminogruppe des Aromaten Sulfanilamid. Das entstehende instabile Zwischen-produkt, ein Diazonium-Ion, reagiert mit N-(1-Naphtyl)ethylendiamin Dihydrochlorid (NED) zu einem roten Azofarbstoff. Die Extinktion wird bei E550 nm photometrisch gemessen.
Farbreagenz
Sulfanilamid C6H8N2O2S 10 g
konz. Phosphorsäure H3PO4 100 mL
NED C12H14N2 * 2 H2O 0,5 g
Aquademin. 1000 mL
Brij-35® 4 mL
2.7.3. Nachweisverfahren Nitrat
Nitrat-Ionen sind im Meerwasser relativ stabil und werden nicht gebunden noch komplexiert. Die Sensitivität der Methode (Methode MT19 G-172-96 Rev.7) liegt zwischen 0,44 bis 0,57 µmol/L Nitrat bei einer Probenkonzentration von 21-285 µmol/L (Hansen & Koroleff 1999). Die während der Messungen ermittelte Sensitivität betrug ±0,104 µmol/L (n=10). Die Analysemethode nutzt eine Kupfer-Cadmium Reduktionssäule um die Reduktion von Nitrat zu Nitrit zu katalysieren (1). Als metallischer Katalysator dient ein grobes Cadmiumgranulat mit einer Kupferum-mantelung (0,3-0,8 mm Korngröße). Da aber die ständige Reduktion den pH Wert vergrößern würde und die Pufferkapazität des Seewassers nicht ausreicht, wird dem Reagenziengemisch als Puffer eine Ammoniumchloridlösung mit einem pH von 8,5 ±0,1 pH hinzugefügt. Ammoniumchlorid fungiert gleichzeitig als Puffer und Komplexbildner (2,3). Die zwei entstehenden Hydroxyl-Ionen werden abgefangen und Ammoniak wird in einem Diamin-Komplex gebunden (4). Die Konzentration der entstehenden Nitrit-Ionen wird nach der oben beschriebenen Methode zum Nachweis von Nitrit durch Bildung eines Azofarbstoffs photometrisch bestimmt.
NO3
Farbreagenz
Sulfanilamid C6H8N2O2S 10 g
konz. Phosphorsäure H3PO4 100 mL
NED C12H14N2 * 2 H2O 0,5 g
Aquademin. 1000 mL
2.7.4. Nachweisverfahren Phosphat
Die Sensitivität der Methode (Methode MT18 G-175-96 Rev.8) nach Murphy & Riley liegt bei 0,40 bis 0,46 µmol/L ortho-Phosphat bei einer Probenkonzentration von 26-260 µmol/L (Hansen & Koroleff 1999). Die während der Messungen ermittelte Sensitivität betrug ±0,025 µmol/L (n=10). Sie basiert auf der Reaktion von ortho-Phosphat in saurer Ammoniummolybdat-Lösung in Gegenwart von Antimon-Ionen (Kalium-Antimon-Tartrat). Es entsteht ein Antimonylphosphomolybdat Komplex, der durch Ascorbinsäure im Überschuss zu Phosphormolybdänblau reduziert wird. Die Extinktion wird bei E880 nm gemessen.
Antimon-Kalium Tartrat-Lösung
Antimon-Kalium Tartrat K(SbO)C4H4O6 * 4 H2O 2,3 g
Aquademin. 100 mL
Ammoniummolybdat Lösung [(NH4)6MO7O24] 6 g
konz. Schwefelsäure H2SO4 64 mL
Antimon-Kalium Tartrat Lösung K(SbO)C4H4O6 * 4 H2O 22 mL
Ascorbinsäure-Lösung
Ascorbinsäure C6H8O6 8 g
Aceton C3H6O 45 mL
Natriumdodecylsulfat, SDS C12H25NaO4S 8 g
Aquademin. 1000 mL