Material und Methoden
3.3 Nährmedien und Puffer
SOB-Medium
Trypton 20,00 g Hefeextrakt 5,00 g
NaCl 0,60 g
KCl 0,20 g
MgCl2 0,95 g
MgSO4 2,41 g
SOC-Medium
Trypton 20,00 g Hefeextrakt 5,00 g
NaCl 0,60 g
KCl 0,20 g
MgCl2 0,95 g
MgSO4 2,41 g
Alle Bestandteile wurden in bidest. Wasser gelöst, auf 980 ml aufgefüllt und autoklaviert.
Anschließend wurden 20 ml einer sterilen 1 M Glucoselösung steril zugegeben.
Nährmedien zur Kultivierung von Ascomyceten
Zur Herstellung der entsprechenden Medien wurden zur Selektion mittels Auxotrophiemarker entsprechende Zusätze (Tab. 3-10) vor dem Autoklavieren hinzugefügt. Im Fall von Festmedien wurden 1,5 % Agar hinzugegeben.
AMM-Medium
NaNO3 6,0 g
Glucose 10,0 g
KCl 0,52 g
MgSO4 7H2O 0,52 g
KH2PO4 1,52 g
Alle Bestandteile wurden in bidest. Wasser gelöst, der pH auf 6,5 eingestellt und autoklaviert.
CDH-Medium
Czapex Dox 35,0 g Hefeextrakt 5,0 g
Alle Bestandteile wurden in bidest. Wasser gelöst und autoklaviert.
GMM-Medium
Glucose 10,0 g 20 x Nitratsalze (Tab. 3-18) 50,0 ml
Alle Bestandteile wurden in bidest. Wasser gelöst, der pH auf 6,5 eingestellt und autoklaviert.
HM-Medium
Hefeextrakt 4,0 g
Malzextrakt 10,0 g
Glucose 4,0 g
Alle Bestandteile wurden in bidest. Wasser gelöst, der pH auf 5,5 eingestellt und autoklaviert.
YG-Medium
Hefeextrakt 5,0 g
Glucose 20,0 g
PD-Medium
Potato Dextrose 24,0 g
Alle Bestandteile wurden in bidest. Wasser gelöst, der pH auf 5,5 eingestellt und autoklaviert.
YPD-Medium
Glucose 20,0 g
Hefeextrakt 10,0 g
Pepton 20,0 g
Alle Bestandteile wurden in bidest. Wasser gelöst und autoklaviert.
PDS-Medium
Potato Dextrose 24,0 g
Saccharose 342,3 g
Alle Bestandteile wurden in bidest. Wasser gelöst und autoklaviert.
Antibiotika und Zusätze Antibiotika
Antibiotikalösungen wurden mit einem Spritzenfilter (Porengröße 0,2 µm) sterilfiltriert, anschließend aliquotiert und bei -20 °C gelagert. Bei Festmedien fand die Zugabe von Antibiotika unter sterilen Bedingungen nach dem Autoklavieren und Abkühlen des Mediums auf unter 60 °C statt.
Tab. 3-9: Verwendete Antibiotika.
Antibiotikum Konz. der Stammlösung [mg/ml]
Lösungsmittel Konz. der Arbeitslösung [µg/ml]
Hersteller
Carbenicillin 50 Wasser 50 Roth
Chloramphenicol 50 Ethanol 12,5 Roth
Kanamycin 50 Wasser 25 Roth
Tetrazyklin 12,5 Wasser 12,5 Roth
Supplementierung bei Verwendung von Auxotrophiemarkern
Tab. 3-10: Verwendete Zusätze (Wachstumsfaktoren).
Zusatz (Supplement) Endkonzentration [g/l] Hersteller
L-Arginin 0,5 Roth
Pyridoxin-Hydrochlorid 0,5 Roth
Riboflavin 0,0025 Roth
Uracil 1,0 Acros Organics
Uridin 2,4 Roth
Puffer und Lösungen
Soweit nicht anders beschrieben, wurden die Puffer mit bidest. Wasser angesetzt, autoklaviert und bei Raumtemperatur gelagert.
Puffer und Lösungen zur DNA-Isolierung
Tab. 3-11: Puffer und Lösungen zur Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli.
Puffer/Lösung Zusammensetzung Anmerkung
Miniprep-Lösung I Tris-Base EDTA
50 mM 10 mM
Auf pH 8,0 einstellen und autoklavieren.
Vor Gebrauch 10 µg/ml RNase A zugeben
Miniprep-Lösung II NaOH SDS
0,2 M 1 % (w/v)
Nicht autoklavieren Miniprep-Lösung III Kaliumacetat 3 M Auf pH 5,2 einstellen
und autoklavieren.
TE-Puffer Tris-HCl EDTA
10 mM 1 mM
Auf pH 7,5 einstellen und autoklavieren.
Tab. 3-12: Puffer und Lösungen zur Isolierung von DNA aus Pilzen.
Puffer Zusammensetzung Konzentration
Breaking buffer NaCl Tris-HCl EDTA Triton 100 SDS
100 mM 10 mM 1 mM 2 % (v/v) 1 % (w/v) Auf pH 7,5 einstellen und autoklavieren.
Lysis-Puffer Tris-HCl EDTA SDS
2-Mercaptoethanol
50 mM 50 mM 3 % (w/v) 1 % Digestion buffer (DB) NaCl
Trizma Base EDTA
SDS
100 mM 10 mM 25 mM 0,5 % (w/v) Auf pH 8,0 einstellen und autoklavieren.
Puffer und Lösungen zur Transformation von E. coli
Tab. 3-13: Puffer und Lösungen zur Transformation von E. coli.
Puffer/Lösung Zusammensetzung Konzentration
0,1 M CaCl2-Lösung Calciumchlorid 0,1 M 0,1 M CaCl2-Lösung
(mit Glycerin)
Calciumchlorid Glycerin
0,1 M 15 % (v/v) 10 %ige Glycerin-Lösung Glycerin 10 % (v/v)
TB-Lösung PIPES
Calciumchlorid Kaliumchlorid
10 mM 15 mM 250 mM
Puffer und Lösungen zur DNA-Gelelektrophorese
Tab. 3-14: Puffer und Lösungen zur DNA-Gelelektrophorese.
Puffer Zusammensetzung Konzentration
50 x TAE-Puffer Tris-Base Essigsäure 96 % EDTA (pH 8,0)
2 M 1 M 50 mM 6 x Ladepuffer Glycerin
Bromphenolblau
30 % (w/v) 0,25 % (w/v)
Puffer zur Proteinaufreinigung
Tab. 3-15: Puffer zur Reinigung von Proteinen mittels Nickel-Affinitätschromatographie.
Puffer Zusammensetzung Konzentration
Lysepuffer NaH2PO4 NaCl Imidazol
50 mM 300 mM 10 mM Auf pH 8,0 einstellen und autoklavieren.
Waschpuffer NaH2PO4 NaCl Imidazol
50 mM 300 mM 20 mM Auf pH 8,0 einstellen und autoklavieren.
Elutionspuffer NaH2PO4/Na2HPO4 NaCl
Imidazol
50 mM 300 mM 250 mM Auf pH 8,0 einstellen und autoklavieren.
Proteinlagerungspuffer Tris-HCl Glycerin
50 mM (pH 7,5) 15 % (v/v) Auf pH 7,5 einstellen und autoklavieren.
Sämtliche Puffer wurden bei 4 °C gelagert.
Tab. 3-16: Lösungen und Puffer zur SDS-PAGE und Coomassie-Färbung.
Bezeichnung Zusammensetzung Endkonzentration
Trenngel (12 %) Maße:
(8 cm × 5,8 cm
× 0,75 mm)
Tris-HCl (pH 8,8) Rotiphorese® Gel 30 SDS
TEMED APS
bidest. Wasser
375 mM 12 % (w/v) 0,1 % (w/v) 0,1 % (w/v) 0,1 % (w/v) ad 5 ml Sammelgel (4 %)
Maße:
(8 cm × 1,5 cm
× 0,75 mm)
Tris-HCl (pH 6,8) Rotiphorese® Gel 30 SDS
TEMED APS
bidest. Wasser
125 mM 4 % (w/v) 0,1 % (w/v) 0,1 % (w/v) 0,1 % (w/v) ad 5 ml 10 × SDS-Puffer Tris-Base
Glycin SDS
bidest. Wasser
250 mM 192 mM 1 % (w/v) ad 500 ml 5 × Protein-
Probenpuffer (Lagerung: -20 °C)
Tris-HCl (pH 6,8) DTT
SDS
Bromphenolblau Glycerin
bidest. Wasser
250 mM 500 mM 10 % (w/v) 0,5 % (w/v) 50 % (v/v) ad 10 ml
Färbelösung Coomassie
Coomassie Brilliant Blau G-250 Essigsäure
Methanol bidest. Wasser
1 % (w/v) 10 % (v/v) 50 % (v/v) ad 1000 ml Entfärberlösung
Coomassie
Ethanol Essigsäure bidest. Wasser
20 % 10 % ad 500 ml
Puffer für die Größenausschlusschromatographie und das Bradford-Reagenz zur Proteinkonzentrationsbestimmung
Tab. 3-17: Puffer für die Größenausschlusschromatographie und das Bradford-Reagenz zur Proteinkonzentrationsbestimmung.
Puffer Zusammensetzung Konzentration
FPLC-Puffer Tris-Base NaCl
50 mM 150 mM
Auf pH 8,0 einstellen und autoklavieren. Lagerung bei 4 °C Serva Blau Lösung Serva Blau G 250
Ethanol
16,4 mM ad 50 ml 5 × Bradford Reagenz Serva Blau Lösung
Phosphorsäure (85 %) bidest. Wasser
25% (v/v) 50% (v/v) ad 200 ml
Das 5 × Bradford Reagenz wurde über Nacht im Dunkeln bei 4 °C gelagert und am nächsten Tag über einen Faltenfilter filtriert (Bradford 1976). Die weitere Lagerung erfolgte ebenfalls bei 4 °C.
Puffer, Lösungen und Medien für die Protoplastierung und Transformation von A. nidulans TN02A7
Tab. 3-18: Puffer, Lösungen und Medien für die Protoplastierung und Transformation von A. nidulans TN02A7
Puffer/Lösung Zusammensetzung Konzentration/Volumen/
Menge
Tween-Lösung Tween® 20 0,1 % (v/v)
Lösung A für das osmotische Medium
NaH2PO4 x H2O 0,1 M
Lösung B für das osmotische Medium
Na2HPO4 x 7 H2O 0,2 M
Lösung C für das osmotische Medium
Lösung A Lösung B
7,0 ml 93,0 ml Auf pH 7,9 einstellen und autoklavieren.
Osmotisches Medium Mg2SO4 x 7 H2O Lösung C
1,2 M 5,0 ml
Auf pH 5,2 einstellen, sterilfiltrieren und Lagerung bei 4 °C.
Trapping Buffer Sorbitol Tris-HCl
600 mM 100 mM
Auf pH 7,0 einstellen, autoklavieren und Lagerung bei 4 °C.
STS Puffer Sorbitol Tris-HCl CaCl2
1,2 M 10 mM 10 mM
Auf pH 7,5 einstellen, autoklavieren und Lagerung bei 4 °C.
CaCl2-Lösung CaCl2 1,0 M
PEG-Lösung PEG3350 60 % (v/v)
Calcium-PEG-Lösung 1 M CaCl2
PEG-Lösung
150 µl ad 3 ml Vor jedem Gebrauch frisch herstellen.
20x Nitratsalze NaNO3
KCl
Mg2SO4 x 7 H2O KH2PO4
120,0 g 10,4 g 10,4 g 30,4 g Spurenelemente ZnSO4 x 7 H2O
H3BO3
MnCl2 x H2O FeSO4 x 7 H2O CoCl2 x 5 H2O CuSO4 x 5 H2O
(NH4)6Mo7O24 x 4 H2O Na4EDTA
bidest. Wasser
2,2 g 1,1 g 0,5 g 0,5 g 0,16 g 0,16 g 0,11 g 5,0 g ad 100 ml Auf pH 6,5 einstellen und sterilfiltrieren.
Bottom-Medium Czapek Dox Saccarose Agar
35 g 0,8 M 16 g Top-Agar 20x Nitratsalze
Spurenelemente Glucose
Sorbitol Agar
10 ml 0,5 ml 2 g 44 g 1,5 g
Auf pH 6,5 einstellen und vor Verwendung auf 40 °C abkühlen lassen.