Da bereits durch die Detektion des TLR2 bzw. TLR4 auf Proteinebene per FACS- Analyse gezeigt werden konnte, dass IL- 13 sich auf die oberflächliche Expression dieser TLRs auf J774- Zellen auswirkt, sollte im Anschluss daran die Auswirkung von IL- 13 auf die Expression von TLR2 bzw.
TLR4 auf mRNA- Ebene untersucht werden. Hierfür wurden J774- Zellen mit TLR- spezifischen Liganden wie folgt unter sterilen Bedingungen stimuliert: IL- 13 (20 ng/ml), PGN (10 µg/ml), LPS (1 µg/ml), PGN (10 µg/ml)+ IL- 13 (20 ng/ml), LPS (1 µg/ml)+ IL- 13 (20 ng/ml) und PGN (10 µg/ml)+
LPS (1 µg/ml)+ IL- 13 (20 ng/ml). Die Inkubation unter Standardbedingungen erfolgte für alle TLR- spezifischen Liganden für 13 h. IL- 13 wurde gleichzeitig mit den TLR- spezifischen Liganden verabreicht. Nach mRNA Extraktion mittels TRIZOL wurde die mRNA mit dem SuperScript III First- Strand Synthesis SuperMix von Invitrogen in die entsprechende cDNA umgeschrieben und anschießend in einer quantitativen real- time PCR analysiert.
3.5.1 mRNA- Expression des Toll- like Rezeptor 2
Abb.19: IL- 13 reduziert die TLR2 mRNA- Expression in stimulierten J774- Zellen
Quantitative real- time PCR zur Bestimmung der TLR2 mRNA- Expression in J774- Zellen. Zellen wurden bis zur Adhärenz 5 h mit serumhaltigen Medium und anschließend weitere 5 h mit serumfreien Medium inkubiert. Anschließend folgte die Stimulation mit IL- 13 (20 ng/ml), PGN (10 µg/ml), LPS (1 µg/ml), PGN (10 µg/ml)+ IL- 13 (20 ng/ml), LPS (1 µg/ml)+ IL- 13 (20 ng/ml) und PGN (10 µg/ml)+ LPS (1 µg/ml)+ IL- 13 (20 ng/ml). Die Inkubation von IL- 13 bzw. der TLR- spezifischen Liganden PGN und LPS erfolgte für 13 h. Werte sind relativ zum Housekeeping Gen -Aktin und wurden auf das Level der unstimulierten Kontrollzellen normiert. Die Daten werden wiedergegeben als Mittelwerte ± SEM von drei unabhängigen Experimenten.
Sowohl die Stimulation durch PGN wie auch die Stimulation durch LPS bewirkt einen Anstieg der TLR2- Expression auf mRNA- Ebene: So führt, jeweils verglichen mit unstimulierten Kontrollzellen, PGN zu einer 3,4 fach und LPS zu einer 4,1 fach erhöhten Expression des TLR2 in J774- Zellen.
Werden die Zellen neben den TLR- spezifischen Liganden zusätzlich mit IL- 13 stimuliert, kann ein Rückgang dieser durch die jeweiligen Liganden hervorgerufenen zusätzlichen Expression gezeigt werden: IL- 13 reduziert die Expression der mit PGN- stimulierten Zellen höchst signifikant um 59,48% (P< 0.0001) und die der mit LPS stimulierten Zellen signifikant um 73,90% (P< 0.05).
Werden die Zellen nur mit IL- 13 alleine stimuliert, verringert sich die Expression des TLR auf das 0,78 fache. IL- 13 verringert daher die TLR2 mRNA- Expression in stimulierten J774- Zellen.
3.5.2 mRNA- Expression des Toll- like Rezeptor 4
Abb.20: TLR- spezifische Liganden verringern die TLR4 mRNA- Expression in J774- Zellen
Quantitative real- time PCR zur Bestimmung der TLR4 mRNA- Expression in J774- Zellen. Zellen wurden bis zur Adhärenz 5 h mit serumhaltigen Medium und anschließend weitere 5 h mit serumfreien Medium inkubiert. Anschließend folgte die Stimulation mit IL- 13 (20 ng/ml), PGN (10 µg/ml), LPS (1 µg/ml), PGN (10 µg/ml)+ IL- 13 (20 ng/ml), LPS (1 µg/ml)+ IL- 13 (20 ng/ml) und PGN (10 µg/ml)+ LPS (1 µg/ml )+ IL- 13 (20 ng/ml). Die Inkubation von IL- 13 bzw. der TLR- spezifischen Liganden PGN und LPS erfolgte für 13 h. Werte sind relativ zum Housekeeping Gen -Aktin und wurden auf das Level der unstimulierten Kontrollzellen normiert. Die Daten werden wiedergegeben als Mittelwerte ± SEM von drei unabhängigen Experimenten.
Durch die Stimulation mit den TLR- spezifischen Liganden PGN und LPS reduziert sich die TLR4 mRNA- Expression in allen Stimulationen enorm. Im Vergleich mit unstimulierten Kontrollzellen, welche auf den Wert 1 normiert wurden, ist in der PGN- Stimulation der 0,36 fache und bei den mit LPS stimulierten Zellen der 0,38 fache Wert der TLR4 mRNA- Expression festzustellen. Werden die Zellen zusätzlich mit IL- 13 stimuliert, ändert sich die mRNA- Expression im Vergleich mit den TLR spezifischen Stimulationen wie folgt: Die TLR4- Expression der PGN- Stimulation geht um weitere 13,8% sowie die der LPS- Stimulation um 72,1% zurück.
Aus der alleinigen Stimulation der Zellen mit IL- 13 folgt ein Rückgang der TLR4 mRNA- Expression um 29% auf das 0,71 fache des normierten Ausganswertes.
3.5.3 CD14 mRNA- Expression stimulierter J774- Zellen
In etwaigen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass CD14 eine entscheidende Funktion in der Aktivierung des TLR4- MD2 Komplexes hat, indem es zum einen die Sensitivität dieses Rezeptorkomplexes für seinen Liganden LPS zu steigern scheint und zudem eine unabdingbare Voraussetzung zur Aktivierung des MyD88- unabhängigen TLR4- Signalweges darstellt. Im Folgenden wurde untersucht, welchen Einfluss IL- 13 auf die mRNA- Expression von CD14 in unstimulierten und mittels PGN bzw. LPS stimulierten Zellen hat. Hierfür wurden J774- Zellen mit TLR- spezifischen Liganden wie folgt unter sterilen Bedingungen stimuliert: IL- 13 (20 ng/ml), PGN (10 µg/ml), LPS (1 µg/ml), PGN (10 µg/ml)+ IL- 13 (20 ng/ml) und LPS (1 µg/ml)+ IL- 13 (20 ng/ml). Die Inkubation unter Standardbedingungen erfolgte für alle TLR- spezifischen Liganden für 13 h. IL- 13 wurde gleichzeitig mit den TLR- spezifischen Liganden verabreicht. Nach mRNA Extraktion mittels TRIZOL wurde die mRNA mit dem SuperScript III First- Strand Synthesis SuperMix von Invitrogen in die entsprechende cDNA umgeschrieben und anschießend in einer quantitativen real- time PCR analysiert.
Abb.21: Auswirkung von IL- 13 auf die CD14 mRNA- Expression in J774- Zellen
Quantitative real- time PCR zur Bestimmung der CD14 mRNA- Expression in J774- Zellen. Zellen wurden bis zur Adhärenz 5 h mit serumhaltigen Medium und anschließend weitere 5 h mit serumfreien Medium inkubiert. Anschließend folgte die Stimulation mit IL- 13 (20 ng/ml), PGN (10 µg/ml), LPS (1 µg/ml), PGN (10 µg/ml)+ IL- 13 (20 ng/ml) und LPS (1 µg/ml)+
IL- 13 (20 ng/ml). Die Inkubation von IL- 13 bzw. der TLR- spezifischen Liganden PGN und LPS erfolgte für 13 h. Werte sind relativ zum Housekeeping Gen -Aktin und wurden auf das Level der unstimulierten Kontrollzellen normiert. Die Daten werden wiedergegeben als Mittelwerte ± SEM von zwei unabhängigen Experimenten.
Verglichen mit der unstimulierten Kontrollgruppe steigt die CD14 mRNA- Expression in den mit LPS stimulierten Zellen um 38% an. Werden jene Zellen nun simultan mit IL- 13 stimuliert ergibt sich hinsichtlich der CD14 mRNA- Expression ein hoch signifikanter Rückgang (P< 0.01) um über 90%.
Bezüglich der mittels PGN bzw. PGN+ IL- 13 stimulierten Zellen ergibt sich kein wesentlicher Unterschied zu den unstimulierten Kontrollzellen. Werden die J774- Zellen lediglich mit IL- 13 stimuliert, kann, verglichen mit den unstimulierten Zellen, ein Rückgang von über 73% verzeichnet werden. IL- 13 verringert daher die CD14 mRNA- Expression in unstimulierten sowie mit LPS stimulierten J774- Zellen.