4.1 Monoklonale Antikörper gegen Furanolabdanditerpene
4.1.1 Monoklonale Antikörper gegen Marrubiin
4 Diskussion
4.1 Monoklonale Antikörper gegen Furanolabdanditerpene
Der Verlust des Proteinkonjugates an Furanolabdanditerpen unter der Dialyse wurde mit MALDI-TOF nachgewiesen. Diese Methode stellt die zur Charakterisierung von Proteinkonjugaten derzeit gängigste Methode dar (Shoyama et al., 1998, Gourlaouën et al., 1998). Die Ergebnisse wurden im weiteren Verlauf der Arbeit durch einen indirekten ELISA bestätigt.
Die Untersuchungen machen deutlich, dass eine einfache Ermittlung der Molekülmasse des Proteinkonjugates per MALDI-TOF zur Charakterisierung des entsprechenden Konjugates gegebenenfalls nicht ausreicht. Die Bestimmung kann zu falsch hohen Werten bei der Bestimmung der Belegungsrate von Proteinkonjugaten führen.
Die Proteinkonjugate wurden zur Immunisierung von zwei Balb/C-Mäusen eingesetzt. Nach Erreichen eines stabilen Antikörpertiters wurden die Milz-Zellen gewonnen und mit Myelom-Zellen fusioniert. Die resultierenden Hybridom-Myelom-Zellen wurden unter Zugabe von HAT-Supplement kultiviert. Alle Arbeiten, die Immunisierung, Fusion, Kultivierung und das erste Screening der Zell-Linien umfassten, wurden in Kooperation mit Frau I. Zündorf, Universität Frankfurt, durchgeführt.
Abb. 4.1 Mikroskopisches Bild einer Hybridom-Zell-Linie. Die Hybidom-Zell-Linien wurden in flachen Anzuchtschalen kultiviert. Die einzelnen Zellen sekretierten die gebildeten Antikörper in das umgebende Nährmedium. Die Aufnahme stammt von I. Zündorf.
In der ersten Immunisierung wurden insgesamt 38 verschiedene Zell-Linien und Subklone etabliert, die ein stabiles Wachstum zeigten und Antikörper gegen Marrubenolsuccinat sekretierten. In der zweiten Immunisierung wurden acht weitere derartige Linien gewonnen.
Von den 46 Zell-Linien fielen besonders die Antikörper von 1C1, 5F2, 6A1, 6C5, 9B5 und 9C1 durch hohe Absorptionen im ELISA auf. Die Absorptionen können in einer hohen Antikörperkonzentration im Zellkultur-Überstand oder in einer hohen Affinität der Antikörper zu dem entsprechenden Antigen begründet liegen.
In einem kompetitiven ELISA (Kemeny, 1994, Durchführung s. Abschnitt 2.6.4) sollte mit Hilfe verschiedener ähnlicher Strukturen das Epitop untersucht werden, an das die Antikörper der einzelnen Zell-Linien binden. Der kompetitive ELISA lieferte jedoch nur reproduzierbare Ergebnisse, wenn folgende Parameter eingehalten wurden:
1. Proteinkonjugat
Im Rahmen des ELISA wurden zur Immobilisierung des Antigens in der Mikrotiterplatte wiederum die Proteinkonjugate von Marrubenolsuccinat mit Thyroglobulin bzw. BSA eingesetzt, da sie das Antigen gerichtet präsentieren. Die Hydrolyseempfindlichkeit der Konjugate wurde bereits diskutiert. Auch die Empfindlichkeit des ELISA wurde durch die abnehmende, relativ geringe Belegung der Proteinkonjugate beeinträchtigt.
Eine Alternative zu den bisher verwendeten Marrubenolsuccinat-Konjugaten kann gegebenenfalls ein Konjugat auf der Basis von Marrubiinsäure bieten. Marrubiin kann alkalisch zu Marrubiinsäure (Hardy et al., 1957) reduziert und die entstehende Carboxylgruppe der Marrubiinsäure zur Bindung des Isoprenoids nach der Methode des gemischten Anhydrids genutzt werden. Im resultierenden Konjugat wird das Isoprenoid durch den fehlenden Spacer nicht sehr weit aus dem Protein herausgehoben, was zu sterischen Problemen bei der Anheftung der Antikörper führen kann. Auch eine direkte, gerichtete Bindung des Diterpens an die Oberfläche der Mikrotiterplatte ist eine alterantive Strategie, um die problematische Verwendung des Marrubenolsuccinat- Proteinkonjugates im ELISA zu vermeiden.
2. Zellkultur-Überstand
Der verwendete Zellkultur-Überstand mit den darin enthaltenen monoklonalen Antikörpern musste möglichst frisch sein, zumindest jedoch bei -20°C gelagert werden. Selbst mit diesen Vorsichtsmaßnahmen nahm die Aktivität der Antikörper langsam ab.
Im optimierten kompetitiven ELISA konnte Marrubiin als Kompetitor mit den Antikörpern der Zell-Linie 6A1 bis zu einer Konzentration von 0,75 nmol / 100µl nachgewiesen werden.
Weitere Kompetitoren waren die Furanolabdanditerpene Marrubenol und Galeopsin sowie Furan-3-carbonsäure. Sclareol oder Leosibiricin, welche Labdanditerpene ohne Furan- bzw.
mit Präfuransystem sind, zeigten keine konzentrationsabhängige Kompetition. Die Antikörper der Zell-Linie 6A1 sind daher gegen 3-substituierte Furanringe gerichtet.
Antikörper gegen ein derart gestaltetes Epitop waren aus theoretischen Überlegungen heraus zu erwarten: Die Abb. 4.2 gibt die Struktur des Marrubenolsuccinates in ungefährer räumlicher Darstellung wieder. Durch die Verknüpfung der freien Carboxylgruppe (s. Pfeil) des Bernsteinsäure-„Spacers“ mit dem Proteinträger wird besonders der am entgegengesetzten Ende des Moleküls befindliche Furanring an der Oberfläche des Konjugates dem Immunsystem der Maus präsentiert.
Abb. 4.2 Dreidimensionale Darstellung von Marrubenolsuccinat. Die Struktur von Marrubenolsuccinat wurde mit Hilfe des Programms Cerius II auf ein energetisches Minimum gerechnet. Die wiedergegebene Struktur ist nicht von kristallographischen Messungen gestützt, sie gibt nur eine grobe Näherung wieder. Die freie Carboxylgruppe des Bernsteinsäuresubstituenten wurde mit einem Pfeil markiert. Der graue Bereich markiert den wahrscheinlichsten Angriffspunkt der mAK verschiedener Zell-Linien an das Furanolabdanditerpen entsprechend dem kompetitiven ELISA.
Die Zell-Linien 1C1C11, 5F2, 9C1C8 und 6C5 wurden ebenfalls mit Hilfe des kompetitiven ELISA charakterisiert: Die Antikörper der Zell-Linie 1C1C11 scheinen ein Epitop zu erkennen, das dem der Linie 6A1 ähnelt. Auch hier wurde Kompetition mit Furan-3-carbonsäure nachgewiesen. Die Antikörper der Zell-Linie 5F2 zeigten nur Kompetition mit Marrubenolsuccinat und mit Bernsteinsäure. Die Existenz solcher Antikörper bestätigte indirekt die Esterhydrolyse des Marrubenolsuccinats vom Konjugat. Die mAK sind gegen den Succinat-„Spacer“ gerichtet.
9C1C8 und 6C5 bilden Antikörper, die keine Kompetition mit Furan-3-carbonsäure zeigten.
Andererseits kompetierten sie mit Sclareol, einem Labdan-Diterpen ohne Furan-Substituent.
Das Epitop umfasst daher vermutlich Teile des Labdangrundgerüstes. 6C5 kompetierte auch mit Galeopsin, einem weiteren Labdanditerpen. Es sind zusätzliche Untersuchungen und auch weitere Kompetitor-Substanzen notwendig, um die Antikörper dieser Zell-Linien zu charakterisieren.
Die generierten und z.T. vollständig charakterisierten monoklonalen Antikörper sind die ersten Antikörper überhaupt, die gegen ein Furanolabdanditerpen als Zielstruktur gerichtet sind. Gegen das Labdanditerpen Forskolin entwickelten Sakata et al. (1994) monoklonale Antikörper. Forskolin aus Coleus forskohlii ist ein Aktivator der Adenylatcyklase (Metzger et al., 1981). Die Autoren erhielten zwei verschiedene Zell-Linien, die IgG gegen das Labdan produzierten. Eine der Linien wurde mit sechs verschiedenen Kompetitoren untersucht, von denen nur eine Substanz (7-Deacetylforskolin) eine 5%-Inhibition der Bindung zeigte. Eine genauere Charakterisierung des erkannten Epitops wurde nicht durchgeführt.