Molekularer Mechanismus der Phosphorylierung von Ago2-Y529

einmal vollständig wiederholt. EGFP-Signalintensitäten, die mindestens um ein Zweifaches der Standardabweichung vom Messwert der „AllStars negative control siRNAs“ abwichen, wurden als „Treffer“ gewertet, sofern das Ergebnis mit mindestens zwei der drei Kinase-spezifischen siRNAs beobachtet worden war. Wünschenswert wäre die Identifikation der Ago2-Kinase, die zur Phosphorylierung von Y-529 führt. Das hieße laut Arbeitshypothese, dass es infolge ihres knock-down zu einer Abnahme des EGFP-Signals im Vergleich zur Negativkontrolle kommen sollte, da eine reduzierte Y-529-Phosphorylierung gleichbedeutend mit einer Zunahme der Ago-miRNA-Komplexe sein sollte. Die miRNA-vermittelte Repression würde in dem Fall zu- und das Fluoreszenz-Messsignal abnehmen. Leider war jedoch eine signifikante Abnahme der EGFP-Fluoreszenz bei keiner der getesteten Kinasen zu beob-achten (D. Tehler, mündliche Mitteilung). Dagegen wurde eine Zunahme des EGFP-Signals für ca. 20 Kinasen verzeichnet, bei denen es sich größtenteils um Serin-/Threoninkinasen handelte. Derzeit werden die screening-Ergebnisse validiert. Anschließend können sicherlich mehr Aussagen getroffen werden.

Die Kristallstrukturanalyse eines Archaeen Argonaute-Proteins suggeriert einen alternativen Phosphorylierungsmechanismus ohne Tyrosinkinase-Aktivität für den Tyrosinrest im Zentrum der Bindungstasche für das 5!-Ende der kleinen RNA (Ma et al., 2005; Abb. 4.45). Die räumliche Nähe dieser Tyrosinseitenkette und der 5!-Phosphatgruppe der kleinen RNA lässt vermuten, dass der Phosphorylrest auch direkt von der RNA auf das Protein übertragen werden könnte. Die These wurde experimentell überprüft. Dafür wurde die kleine RNA 21.27 am 5!-Ende mit ³²P markiert, während der Gegenstrang 21.28, der später nicht in Ago2 eingebaut wird, keine 5!-Modifikation trug (Martinez et al., 2002). Die gereinigten RNA-Stränge wurden miteinander hybridisiert und die doppelsträngige siRNA für die Assemblie-rung von RISC (Abschnitt 2.4.4) in zytoplasmatischen Extrakten von und FH-Ago2-Y529F-überexprimierender Zellen zusammen mit einer 21.27-spezifischen target-RNA inku-biert. Anschließend wurden die RNA-Protein-Komplexe via !-FLAG-IP gereinigt, gründlich

mit RNase A behandelt und schließlich in Proteinprobenpuffer aufgenommen. Nach der SDS-PAGE wurde das Gel mit Coomassie gefärbt, getrocknet und autoradiographisch analysiert (Abb. 4.50; Abb. 4.51 A und B). Ein Teil der Proben wurde für eine Analyse via

!-HA-Western-Blot verwendet (Abb 4.51 C). Die vollständige Versuchsdurchführung ist schematisch in Abbildung 4.50 zusammengefasst.

Abbildung 4.50

Schematische Darstellung der Versuchsdurchführung zum Phosphorylgruppen-übertrag zwischen kleiner RNA und Ago

Die Proteine von Interesse wurden als FH-Fusionskonstrukte in HEK 293 Zellen expri-miert und von den Zellen schließlich zytoplasmatische Extrakte angefertigt. Ein siRNA-Duplex, dessen in Ago einzubauender Strang eine 5!-³²P-Phosphorylgruppe aufwies, wurde zur Assemblierung von RISC zusammen mit der target-RNA luciII in den Extrak-ten inkubiert. Die RNA-Protein-Komplexe wurden schließlich via Immunopräzipitation mit !-FLAG-Antikörper gereinigt und gründlich mit RNase A behandelt. Die Analyse der Immunopräzipitate erfolgte via Autoradiographie des Coomassie-gefärbten Proteingels und !-HA-Western-Blot. Zur Dokumentation der radioaktiv-markierten kleinen RNA wurden den Reaktionsansätzen während der Versuchsdurchführung Proben entnom-men. Ink., Inkubation; IP, Immunopräzipitation.

Wird die 5!-Phosphorylgruppe der kleinen RNA tatsächlich auf Tyr-529 übertragen, sollte die radioaktive Markierung anschließend bei FH-Ago2 wieder zu finden sein, nicht aber bei der ebenfalls miRNA-bindenden, aber 529-phosphorylierungsdefekten Y529F-Mutante.

Tatsäch-lich konnte im Radiogramm des denaturierenden Proteingels ein radioaktives Signal von ca. 100 kD bei FH-Ago2 nicht aber bei FH-Ago2-Y529F nachgewiesen werden (Abb. 4.51 A).

Es waren Expositionszeiten von sechs Wochen erforderlich, um das schwache Signal zu detektieren. Sowohl die Coomassie-Färbung als auch der !-HA-Western-Blot belegen, dass die Ago2-Y529F-Mutante in gleicher Quantität und Qualität immunopräzipiert worden war (Abb. 4.51 B und C).

Abbildung 4.51

Radioaktive Markierung von FH-Ago2 nicht aber von -Y529F nach Inkubation mit 5!-³²P-siRNA

Von FH-Ago2 und FH-Ago2-Y529F exprimierenden HEK 293 Zellen wurden zytoplas-matische Extrakte hergestellt. Ein siRNA-Duplex aus einem 5!-³²P-markierten guide-Strand und einem 5!-unmodifizierten Gegenstrang wurde zusammen mit der dazuge-hörigen target-RNA in den Extrakten inkubiert. Anschließend wurden die FH-Fusions-proteine immunopräzipitiert und mit RNase A behandelt (vgl. Abb. 4.50). (A) Autoradio-gramm des Coomassie-gefärbten Proteingeles zur Analyse der nach Größe aufge-trennten Immunopräzipitate. Der Größenstandard gibt die Molekülmassen in kD wieder.

(B) Coomassie-gefärbtes Proteingel vor der Trocknung. Sterne (#) markieren die Position der Fusionsproteine im unter (A) gezeigtem Radiogramm bzw. im Gel (B). (C)

!-HA-Western-Blot. Von den in Proteinprobenpuffer aufgenommenen Immunopräzi-pitaten wurden 10 Vol.-% via !-HA-Western-Blot analysiert. WT, Wildtyp.

Um auszuschließen, dass der Abbau der kleinen RNA eventuell unvollständig war und die RNA weiterhin in einem Komplex mit dem Fusionsprotein vorliegt, wurden Proben zur Doku-mentation des RNA-Degradationszustandes entnommen. Von diesen Proben wurden Ali-quots vergleichbarer radioaktiver Strahlungsintensität in einem denaturierenden RNA-Gel der Größe nach aufgetrennt. Das Autoradiogramm dieses Geles belegt, dass die RNase A-Behandlung sowohl beim FH-Ago2- als auch beim FH-Ago2-Y529F-Ansatz zu einem im Rahmen der Detektionsgrenzen vollständigen Abbau der ³²P-RNA geführt hatte (Abb. 4.52).

Abbildung 4.52

Dokumentation des Abbaus der 5!-³²P-markierten kleinen RNA durch RNase A

Für die qualitative Analyse der 5!-³²P-21.27-RNA vor und nach deren Einbau in die Fusionsproteine FH-Ago2 und –Y529F wurden im Rahmen des Versuches zum Phos-phorylgruppentransfer Proben ent-nommen. Aliquots vergleichbarer Strahlungsintensität wurden einer denaturierenden RNA-PAGE unter-zogen und autoradiographisch ana-lysiert. Das Autoradiogramm ist dar-gestellt. Signale bekannter Identität sind gekennzeichnet. Die Probenbe-zeichnung und die Entnahmezeit-punkte erschließen sich aus Abb.

4.50. WT, Wildtyp; Ink., Inkubation.

Um zu kontrollieren, dass das an FH-Ago2 detektierte, radioaktive Signal auf den 5!-Phos-phatrest der RNA zurückgeht und nicht auf unspezifischen Abbauprodukten beruht, wurde das Experiment zum Phosphorylgruppenübertrag mit der radioaktiven Markierung am 3!-Ende des in RISC einzubauenden RNA-Stranges wiederholt. Modifikationen am 3!-Ende stören die RISC-Assemblierung nicht (Martinez et al., 2002; Chiu und Rana, 2003; Soutschek et al., 2004). Bei Verwendung 3!-markierter RNA sollte kein Übertrag des radioaktiven Phos-phorisotops auf Ago erfolgen. Tatsächlich konnte dem Radiogramm kein entsprechendes Signal entnommen werden (Abb. 4.53 A), trotz längerer Expositionszeit als im Experiment mit der 5!-³²P-markierten RNA (Abb. 4.51 A) und hinreichender Quantität der Fusionsproteine FH-Ago2 und –Y529F (Abb. 4.53 B und C).

Die erhaltenen Ergebnisse sprechen dafür, dass unter den verwendeten experimen-tellen Bedingungen, die 5!-Phosphorylgruppe von der kleinen RNA auf Y529 von Ago2 über-tragen werden kann (Abb. 4.51), und dass der Phosphatrest nicht unspezifischen Abbaupro-zessen entstammt (Abb. 4.53).

Abbildung 4.53

Kein Übertrag einer 3!-³²P-Markierung einer kleinen RNA auf Argonaute

Das in Abb. 4.50 skizzierte Experiment wurde mit FH-Ago2- und FH-Ago2-Y529F-haltigen Zytoplasmaextrakten von HEK 293 Zellen und der target-RNA luciII wiederholt.

Diesmal war jedoch das 3!-Ende des in Ago einzubauenden Stranges radioaktiv mar-kiert. (A) Radiogramm des Coomassie-gefärbten und getrockneten Proteingeles. Die RNase A-behandelten Immunopräzipitate wurden einer SDS-PAGE und Coomassie-Färbung unterzogen. Vom getrockneten Gel wurde über mehr als sechs Wochen ein Autoradiogramm aufgenommen, das dargestellt ist. Ein Größenstandard ist eingezeich-net. (B) Das Coomassie-gefärbte Proteingel vor der Trocknung. Sterne (#) markieren die erwartete Position der Fusionsproteine im Radiogramm (A) bzw. im Gel (B).

(C) !-HA-Western-Blot. Von den in Proteinprobenpuffer aufgenommenen Immunoprä-zipitaten wurden 10 Vol.-% via !-HA-Western-Blot analysiert. (D) Radiogramm des denaturierenden RNA-Geles nach kurzer Elektrophoresedauer zur Dokumentation der

32P-RNA-Degradation durch RNase A. Die Erklärung der Probenbezeichnung ist Abb.

4.50 zu entnehmen. Das Rautensymbol ($) markiert ein Signal unbekannter Identität.

WT, Wildtyp; Ink., Inkubation.

4.2.4.5 Untersuchungen zur Tyrosinphosphorylierung des