Molekulare Grundlagen der Regulation der EBER-Gene

DNase I in vitro Footprint. DNase I in vitro Footprint-Experimente wurden zum Nachweis der Faktoren, die an der Regulation der EBER-Transkription beteiligt sind, eingesetzt. Obwohl es theoretisch möglich ist, mit dieser Methode über einen größeren DNS-Bereich die Stärke der Bindung von schon bekannten Faktoren, als auch die Bindung neuer Faktoren zu ermitteln, stellte sich dies in diesem Zusammenhang als schwierig heraus. Die Menge an d(IC), die der Reaktion zum Abfangen unspezifischer Bindungen zugegeben wurde, musste sehr hoch eingestellt werden. Nur so konnte eine unspezifische Abdeckung der DNS verhindert werden.

Dies hatte aber zur Folge, dass in diesen Arbeiten die Bindung der Faktoren an die DNS so schwach wurde, dass nur noch die Transkriptionsfaktoren mit sehr hoher Bindungsaffinität und ubiquitärem Vorkommen an die DNS banden.

Die bekannten Faktoren, die vor der kodierenden Sequenz der EBER-Gene binden und für die Transkription wichtig sind, konnten teilweise bestätigt werden. In Übereinstimmung mit den Arbeiten von Howe et al.³⁴ konnte die Bindung von Sp1, ein ubiquitärer Faktor mit starker DNS-Bindungsaffinität, nachgewiesen werden. Der Unterschied zwischen Latenz und produktiver Phase des Virus zeigte sich hier in einer verminderten Bindung des Faktors in beiden Promotoren der EBER-Gene. Dies könnte die allgemein geringere Transkriptionsaktivität der Polymerase III nach chemischer Induktion der viralen Replikation erklären und somit die Abschaltung von EBER-1. Es konnten hingegen keine weiteren Faktoren, erst nach Induktion gebunden hätten, gefunden werden, die die Aufrechterhaltung der Transkription von EBER-2 erklärten. Das DNase I in vitro Footprint –Experiment war in diesem Zusammenhang für die Untersuchung größerer DNS-Bereiche auf die Bindung von Transkriptionsfaktoren mit Rohkernextrakten nicht geeignet, da die Faktoren zu unterschiedliche Reaktionsbedingungen

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benötigten. Auch eine Aufreinigung der Extrakte brachte keine Verbesserung, d.h. es lag nicht an einer zu geringen Konzentration der Faktoren aufgrung einer schlechten Qualität der Extrakte.

Aus diesem Grund wurden einige zum Teil hypothetische Bindestellen für Transkriptionsfaktoren im EMSA gezielt untersucht.

Eine Sequenzvariation in der Bindestelle von ATF im Promotor von EBER-2 in den Virusstämmen P3HR1-16, P3HR1-13 und Akata. Die Analyse der genomischen Sequenz der EBER-Gene aus verschiedenen Virusstämmen zeigte, dass sich in den Zelllinien, die beim Übergang in die Virusvermehrung eine Abschaltung von EBER-1 und zugleich eine konstante Synthese von EBER-2 aufwiesen, ein Nukleotidunterschied in der Bindestelle der Transkriptionsfaktorfamilie ATF im Vergleich zu Virusstämmen befindet, bei denen die EBER-Gene nicht differentiell reguliert waren. Die Bindesequenz TGACGTAG in B95-8- und Raji-Virus ist in den Raji-Virusstämmen P3HR1-16, P3HR1-13 und Akata vor EBER-2 zu TGACGTGG geändert. Eine bessere ATF-Bindestelle könnte einen Grund für die konstante Synthese von EBER-2 nach Induktion der produktiven Virusvermehrung darstellen. Als diese unterschiedlichen Bindesequenzen im EMSA untersucht wurden, zeigte sich, dass dieser Nukleotidunterschied einen Einfluss auf die Bindung von Transkriptionsfaktoren hatte. Diese Unterschiede im Bindemuster in Abhängigkeit von der Bindestelle hatten jedoch keinen Einfluss auf die Expression der EBER-Transkripte. Dies zeigte sich darin, dass in P3HR1-16-Zellen, die mit pNegR-Plasmid (EBER-Reporter-Expressionsplasmid mit der ATF-Bindesequenz aus dem B95-8-Stamm) transfiziert wurden, im Nuclear Run On-Experiment eine Regulation der EBER-Reporter stattfand, die der der endogenen EBER-Gene der P3HR1-16-Zellen entsprach. Somit wurden sowohl die EBER-Gene (mit der Sequenzvariation in der ATF-Bindestelle) als auch die EBER-Reporter (Konsensussequenz aus B95-8-Virus) gleich exprimiert.

Daraus folgte, dass die unterschiedlichen Faktoren aus der ATF-Familie, die in Abhängigkeit von den unterschiedlichen Bindestellen vor EBER-1 und EBER-2 banden, die differentielle Regulation der EBER-Gene nicht erklärten.

NFW als neuer Faktor im Promotor von EBER-2. Die Computeranalyse der Promotoren von EBER-1 und EBER-2 hat einige neue mögliche Bindestellen von bekannten Transkriptionsfaktoren aufgezeigt. Im EMSA wurden zunächst die Bindestellen für GCF und NFW untersucht.

Bei der Bindestelle für GCF wurde im Gegensatz zu der NFW-Bindestelle kein Hinweis auf eine Bindung des spezifischen Faktors in den verwendeten Kernextrakten gefunden. In der Literatur

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ist beschrieben, dass es mindestens zwei Faktoren gibt, die an die NFW-Bindestelle binden können: einen, der generell in B-Zellen vorkommt und einen, der durch Induktion mit TPA oder durch Ausdifferenzierung der Zellen aktiviert wird ¹⁵. In den EMSA-Experimenten konnte nun gezeigt werden, dass in den Zelllinien DG75 und P3HR1-16 neben dem generellen Faktor auch ein weiterer Faktor nach Induktion spezifisch an die NFW-Bindestelle band. Da diese Bindestelle vor EBER-2 liegt und dieser Faktor als Aktivator beschrieben wurde, könnte hiermit die Aufrechterhaltung der Transkription von EBER-2 in induzierten Zellen erklärt werden.

Der funktionelle Nachweis für diese Hypothese konnte aber aus zeitlichen Gründen in dieser Arbeit nicht mehr erbracht werden. Durch Mutation der Bindestelle von NFW sollte in einem funktionellen Nachweissystem wie dem Nuclear Run On-Experiment die konstante Expression von EBER-2 während der viralen Replikation unterbunden sein. Da der Faktor auch in der EBV-negativen Zelllinie DG75 nachgewiesen wurde, würde man erwarten, dass dieser Nachweis auch in diesen Zellen funktionieren sollte.

Theorie der Regulation der Expression der EBER-Gene beim Übergang in die Phase der Virusproduktion. Von den Ergebnissen aus Nuclear Run On-, DNase I in vitro Footprint- Experimenten und EMSA lässt sich folgendes festhalten:

- im Promotorbereich von EBER-1 und EBER-2 vor der kodierenden Sequenz binden die Transkriptionsfaktoren Sp1 und ATF;

- es wurde kein weiterer Transkriptionsfaktor – weder bekannte Aktivatoren, noch Inhibitoren - vor EBER-1 gefunden (DNase I in vitro Footprint und EMSA);

- die Menge an Sp1 im Kern sankt nach 3 Tagen der chemischen Induktion (DNase I in vitro Footprint);

- die Expression von EBER-1 sank vergleichbar der von Serin-tRNS (Nuclear Run On);

- im Promotorbereich von EBER-2 vor der kodierenden Sequenz band NFW nach chemischer Induktion der Virusproduktion (EMSA);

Ausgehend von diesen Ergebnissen könnte die Regulation der Expression der EBER-Gene beim Übergang von der Latenz in die virale Replikation folgendermaßen ablaufen: In latent infizierten Zellen werden EBER-1 und EBER-2 durch die essentielle Bindung von Sp1 und ATF in deren Promotorbereich stark exprimiert. Diese beiden Faktoren sind ausreichend für die hohe Expression. Bei chemischer Induktion der viralen Replikation sinkt zum einen die Transkriptionsaktivität der Polymerase III allgemein (Serin-tRNS), zum anderen verringert sich die Menge an Sp1 im Kern. Dies führt zur geringeren Expression von EBER-1. Bei EBER-2 wird der Rückgang von Sp1 durch die Bindung von NFW, der erst nach Induktion erscheint,

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aufgefangen. Hierdurch kommt es zur Abschaltung von EBER-1, wobei EBER-2 weiter transkribiert wird.