2 Material und Methoden
2.6 Molekularbiologische und genetische Methoden
2.6.1 Plasmidisolierung
Plasmid-DNA wurde aus 5 ml Übernachtkultur mittels des NucleoSpin Plasmid-Kits der Firma Macherey-Nagel (München) nach Angaben des Herstellers isoliert, in 30-50 µl H2Odest aufgenommen und bei -20°C gelagert.
2.6.2 Isolierung genomischer DNA
Genomische DNA wurde aus 2 ml Übernachtkulturen mittels des NucleoSpin Tissue-Kits der Firma Macherey-Nagel (München) nach Angaben des Herstellers isoliert. Es wurde dabei nach dem empfohlenen Protokoll für Gram-negative Bakterien verfahren. Die DNA wurde in 100 µl H2Odest
aufgenommen und bei 4°C gelagert.
2.6.3 Modifikation von DNA
Die in vitro-Veränderungen von DNA-Molekülen, wie Restriktionen und Ligationen, wurden unter den vom jeweiligen Hersteller empfohlenen Bedingungen durchgeführt. Linearisierte Vektoren wurden zur Vermeidung von Religationen für 30 min bei 37°C mit Alkalischer Phosphatase (CIAP) behandelt
2.6.4 Elektrophoretische Auftrennung von DNA
Die analytische und präparative Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgte mittels Agarose-Gelelektrophorese. Dafür wurden Gele mit 1,0-1,5 % (w/v) Agarose in TAE-Puffer verwendet. Vor dem Lauf wurde zu den Proben 1 x Probenpuffer gegeben. Zur Bestimmung der DNA-Fragment-Größen diente ein 1 kb-Leiter-Standard Gene Ruler. Der Gellauf wurde in horizontalen Mini-Gelkammern der Maße 7,5 cm x 7,5 cm bzw. 11 cm x 7,5 cm (Länge x Breite) bei konstant 90 V für 30-60 min durchgeführt. Im Anschluss wurden die Gele im Ethidiumbromid-Färbebad gefärbt.
Die Detektion und Dokumentation der aufgetrennten DNA erfolgte auf einem UV-Transilluminator bei 254 nm.
TAE-Puffer Tris 40 mM
Essigsäure 40 mM
EDTA 1 mM
10 x DNA-Probenpuffer Glycerin 50 %
EDTA 0,1 M
SDS 1 %
Bromphenolblau 0,1 %
Agarosegel Agarose 1,0-1,5 % in TAE-Puffer
Ethidiumbromid-Färbebad 1 μg Ethidiumbromid pro ml H2Odest
2.6.5 Extraktion von DNA aus Agarosegelen
DNA-Fragmente wurden mittels des “QIAquick Gel Extraction Kit” von Qiagen (Hilden) nach Angaben des Herstellers aus Agarosegelen extrahiert.
2.6.6 Photometrische DNAKonzentrationsbestimmung
Die Konzentration von DNA-Proben wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm gemessen. Die Reinheit der Probe wurde durch den Quotienten A260/A280 ermittelt.
2.6.7 Polymerasenkettenreaktion (PCR)
Die Polymerasenkettenreaktion („polymerase chain reaction“, PCR) dient der Vervielfältigung von definierten DNA-Abschnitten und wurde nach Mullis et al. (1986) durchgeführt. Die zu den Randbereichen des zu amplifizierenden Gens komplementären Oligonukleotide wurden von der Firma Metabion (München) hergestellt. Als DNA-Matrize wurde chromosomale DNA (50-100 ng) oder ein Bakterienzelllysat eingesetzt. Zur Gewinnung des Bakterienzelllysates wurden 100 μl einer Übernachtkultur in 900 µl H2Odest gekocht (95 °C, 10 min) und anschließend abzentrifugiert. 1 μl des Überstandes wurde als DNA-Matrize für die PCR verwendet. Als DNA-Polymerasen wurde entweder die AmpliTaq Gold® DNA Polymerase (Applied Biosystems, Darmstadt) oder die Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt) verwendet. Die
Reaktionsansätze und die verwendeten PCR-Programme sind den Tabellen 2.9 und 2.10 zu entnehmen.
Tab. 2.9: Reaktionsansatz und –programm für die AmpliTaq Gold® DNA Polymerase. Die Annealing‐
Temperatur lag 2 °C unter dem Schmelzpunkt der Primerpaare
Reaktionsansatz Reaktionsprogramm
DNA 100 ng Anfangsdenaturierung 94°C 10 min 5’ Primer (100 μM) 0,5 μl
3’ Primer (100 μM) 0,5 μl Denaturierung 94°C 30 sek
dNTP-Mix (2 mM) 5 μl Annealing x°C 30 sek 30 x
10 x Reaktionspuffer 5 μl Elongation 72°C 1 min/kb
DNA Polymerase 0,5 μl
H2Odest ad 50 μl Finale Elongation 72°C 7 min
Tab. 2.10: Reaktionsansatz und –programm für die Phusion™ HighFidelity DNA Polymerase. Die Annealing‐Temperatur lag 2 °C unter dem Schmelzpunkt der Primerpaare
Reaktionsansatz Reaktionsprogramm
DNA 100 ng Anfangsdenaturierung 98°C 30 sek
5’ Primer (100 μM) 0,5 μl
3’ Primer (100 μM) 0,5 μl Denaturierung 98°C 10 sek
dNTP-Mix (2 mM) 5 μl Annealing x°C 15 sek 30 x
5 x Reaktionspuffer 10 μl Elongation 72°C 15 sek/kb
DNA Polymerase 0,5 μl
H2Odest ad 50 μl Finale Elongation 72°C 5 min
2.6.8 Kompetente Zellen und Elektroporation
2.6.8.1 Herstellung elektrokompetenter E. coli Zellen und Elektroporation
Für die Herstellung elektrokompetenter E. coli Zellen wurden die Stämme JM109, DH5α, BL21 (DE3) pLys und BL21 (DE3) CodonPlus verwendet. Eine in LB-Medium angezogene Übernachtkultur wurde 1:50 in LB-Medium verdünnt und bei 37 °C inkubiert. In der logarithmischen Wachstumsphase (OD600 von 0,5-0,6) wurde die Bakteriensuspension für 15-20 min auf Eis gekühlt, anschließend für 10 min bei 4000 U/min 4°C zentrifugiert und zweimal mit H2Odest gewaschen. Es folgten zwei weitere Waschschritte mit 10 % Glycerin/H2Odest. Die so präparierten Bakterien wurden in 10 % Glycerin/H2Odest resuspendiert, als 50 μl Aliquots schockgefroren und bei -80 °C gelagert.
Für die Elektroporation wurden die elektrokompetenten Zellen auf Eis aufgetaut und zusammen mit der DNA in eine Elektroporationsküvette überführt. Die Transformation erfolgte bei 2,5 kV, 200 Ω und 25 µF (time constant > 4ms). Die Zellen wurden anschließend in 1 ml SOC-Medium aufgenommen und für 30 min bei 37°C inkubiert. Im Anschluss wurden die Bakterien auf Selektivagarplatten mit dem entsprechenden Antibiotikum angezogen.
2.6.8.2 Herstellung elektrokompetenter C. jejuni Zellen und Elektroporation
Für die Herstellung elektrokompetenter C. jejuni Zellen wurde der Stamm Lior 11 verwendet. Der Stamm wurde auf vier Blutagarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 37°C unter mikroaerophilen Bedingungen bebrütet. Die Zellen wurden mit je 2 ml BHI-Medium pro Platte geerntet und bei 3000 g für 20 min bei 4°C zentrifugiert. Die Bakterien wurden dreimal mit eiskaltem Waschpuffer gewaschen und im Anschluss in Waschpuffer aufgenommen, in 50 µl Aliquots schockgefroren und bei -80°C gelagert.
Für die Elektroporation wurden die elektrokompetenten Zellen auf Eis aufgetaut und zusammen mit der DNA in eine Elektroporationsküvette überführt. Die Transformation erfolgte bei 2,5 kV, 200 Ω und 25 µF (time constant > 4ms). Die Zellen wurden in 100 µl SOC aufgenommen und auf einer nicht selektiven Agarplatte über Nacht bei 37°C unter mikroaerophilen Bedingungen inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Bakterien mit 1 ml BHI-Medium geerntet und bei 5000 U/min pelletiert.
Die Zellen wurden in 100 µl BHI-Medium resuspendiert und auf einer selektiven Agarplatte für 3-5 Tage bei 37°C unter mikroaerophilen Bedingungen inkubiert.
Waschpuffer Saccharose 272 mM
Glycerin 15 %
2.6.9 DNASequenzanalyse
Die Sequenzierung von doppelsträngiger DNA erfolgte nach dem Prinzip des “Cycle Sequencing”, welches auf dem nach Sanger et al. (1977) beschriebenem Kettenabbruchverfahren mit Didesoxynukleotiden basiert. Die Sequenzanalyse und -auswertung erfolgte durch die Firma Metabion GmbH (Martinsried).
2.6.10 Konstruktion der Plasmide
2.6.10.1 Expressionsplasmide
Für die rekombinante Herstellung neuer potentieller Antigene von Yersinia und C. jejuni wurden die in Tabelle 2.6 beschriebenen Expressionsplasmide konstruiert. Die Plasmide pET21b-myfA, pET21b-myfΔC, pET21b-myfΔNC und pET21b-myfΔN entstanden durch PCR-Amplifikation des myfA Gens von chromosomaler DNA aus Y. enterocolitica O:3 mit den Oligonukleotid-Paaren
myfA_121f_NdeI und myfA_441rev_XhoI bzw. myfA_121f_NdeI und Ye_myfA-rev (Tab. 2.7).
Das Plasmid pET21b-psaA entstand durch die PCR-Amplifikation des psaA Gens von chromosomaler DNA aus Y. pseudotuberculosis I mit dem Oligonukleotid-Paar YpsI-psaA-f-NdeI und YpsI-psaA-rev-XhoI (Tab. 2.7). Die Plasmide pET21b-rtx1, pET21-rtx2 und pET21b-rtx3 entstanden durch PCR-Amplifikation des rtxA Gens von chromosomaler DNA von Y. enterocolitica O:3 mit den Oligonukleotid-Paaren YEO3-rtxA-1f_NdeI und Ye-rtxA_3231rev_XhoI, YEO3_rtxA-3232f_SalI und YEO3_rtxA2-rev_XhoI bzw. YEO3_rtxA_6427f_NdeI und Ye_rtxA_9639rev_XhoI (Tab. 2.7). Für das Plasmid pET21b-yadA72-280 wurde die yadA Kopf- und Halsregion (nt 214-840) vom pYV Plasmid von Y. enterocolitica O:3 mit dem Oligonukleotid-Paar YeO:3-yadA-217f-NdeI und YeO:3-yadA-840rev_XhoI amplifiziert (Tab. 2.7). Die Plasmide jlpA und pET21b-jlpA16-185 wurden durch die PCR-Amplifikation des jlpA Gens von chromosomaler DNA aus C.
jejuni L11 mit den Oligonukleotid-Paaren JlpA1f-Ndei und JlpA1116rev-XhoI bzw. CjjlpA46f-NdeI und CjjlpA555rev-XhoI konstruiert (Tab. 2.7). Für die Plasmide pET21b-flaC und pet21b_ciaB wurde das flaC bzw. ciaB Gen von chromosomaler DNA aus C. jejuni L11 mit den Oligonukleotid-Paaren FlaC1f-NdeI und FlaC747rev-XhoI bzw. CiaB1f-NdeI und CiaB1830rev-XhoI amplifiziert (Tab. 2.7). Die Plasmide pET21b-cadF und pET21b-cadF167-314 entstanden durch die PCR-Amplifikation des cadF Gens von chromosomaler DNA aus C. jejuni L11 mit den Oligonukleotid-Paaren CadF1f-NdeI und CadF957rev-XhoI bzw. CjcadF502f und CjcadF942rev-XhoI (Tab. 2.7).
Die Plasmide pET21b-nlpA und pET21b-yceI wurden durch die PCR-Amplifikation des nlpA bzw.
yceI Gens von chromosomaler DNA aus C. jejuni L11 mit den Oligonukleotid-Paaren CjnlpA94f-NdeI und CjnlpA738rev-XhoI bzw. CjyceI64f-CjnlpA94f-NdeI und CjyceI570rev-XhoI konstruiert (Tab. 7.2).
Für die Plasmide pET21b-Cj0143c und pet21b-Cj1670c wurde das cj0143c bzw. cj1670c Gen von chromosomaler DNA aus C. jejuni L11 mit den Oligonukleotid-Paaren Cj0143c-61f-NdeI und Cj0143c-888rev-XhoI bzw. Cj1670c-55f-NdeI und Cj1670c-660rev-XhoI amplifiziert (Tab. 2.7).
Das Plasmid pET21b-Cj1496c entstand durch die PCR-Amplifikation des cj1496c Gens von chromosomaler DNA aus C. jejuni L11 mit den Oligonukleotid-Paaren Cj1496c-52f-NdeI und Cj1496c-516rev-XhoI (Tab. 2.7).
Die gewonnenen Genabschnitte wurden mit den in Tab. 2.6 genannten Restriktionsenzymen verdaut.
Die Ligation erfolgte in den mit den entsprechenden Enzymen linearisierten Expressionsvektor pET-21b. Bei allen hier beschriebenen, neu konstruierten Plasmiden wurde die Korrektheit durch DNA-Sequenzanalyse verifiziert.
2.6.10.2 Suizidplasmide
Für die Konstruktion einer Flagellen-negativen C. jejuni Mutante wurde das Gen flgC durch die Einführung einer Kanamycin-Kassette inaktiviert. Hierfür wurde ein Suizidplasmid konstruiert, das nicht in Campylobacter Stämmen replizieren und über homologe Rekombination ins das Genom eingebaut werden kann. Zuerst wurde der DNA-Abschnitt 572 Nukleotide stromaufwärts und 796 Nukleotide stromabwärts des flgC Gens von C. jejuni Lior 11 mit den Oligonukleotiden flgCgc-f-NdeI und flgCgc-rev-BamHI amplifiziert und über die flgCgc-f-NdeI/BamHI Schnittstellen in den Vektor pUC18 kloniert, wodurch pUC-flgC entstand. Im Anschluss wurde die Kanamycin-Kassette von pWM1001 unter Hinzufügen der Restriktionsschnittstelle HindIII mit den Oligonukleotiden Kan-f-HindIII und Kan-rev-Kan-f-HindIII amplifiziert. Anschließend wurde die Kanamycin-Kassette in die HindIII Schnittstelle, die in dem flgC Gen liegt, in pUC-flgC ligiert, wodurch das Suizidplasmid pKflgC entstand.
Für das Ausschalten des TAT Sekretionssystems in C. jejuni Lior11 wurde das Gen tatC durch das Einführen einer Kanamycin-Kassette inaktiviert. Zu diesem Zweck wurde ein Suizidplasmid nach van Mourik et al. (2008) konstruiert. Das Gen tatC und die flankierenden Regionen wurden mir den Oligonukleotiden Cj-TAT1 und CjTAT2 amplifiziert und anschließend über die poly-A Überhänge in den Vektor pGEM-T kloniert, um das Plasmid pGEM-TAT12 zu erhalten. Mit einer inversen PCR (Oligonukleotid-Paar Cj-TAT3BamHI und Cj-TAT4BamHI) wurde eine Deletion von 424 bp und eine BamHI Schnittstelle eingeführt. Nach Selbstligation wurde das erhaltene Plasmid pGEM-TAT34 mit BamHI verdaut und mit einer Kanamycin-Kassette ligiert, die mit den Oligonukleotiden Kan-f-BamHI und Kan-rev-BamHI aus dem Plasmid pWM1001 amplifiziert wurde. Das daraus resultierende Suizidplasmid wurde pKTAT genannt.