Molekularbiologische Methoden

4.2.4.1 In vitro - Transkription

Zur Herstellung einer am 5´-Ende triphosphorylierten RNA (3pRNA) bedient man sich der Methode der in vitro - Transkription. Bei dieser Methode wird mit Hilfe einer T7-RNA-Polymerase die RNA beginnend von 5´-Ende in Richtung 3´-Ende synthetisiert. Hierzu benötigt die Polymerase eine DNA-Vorlage (DNA-Template), welche die komplementäre Sequenz der zu synthetisierenden RNA besitzt und außerdem einen doppelsträngigen T7-Polymerase-Promotor.

Zu Herstellung des DNA-Template benötigte man zwei Oligonukleotide (76mer ODN). Das initiale Nukleotid der RNA sollte ein Guanosin darstellen, da dieses die Ausbeute der DNA erhöht. 2µl beider ODNs (Antisense 3´/ Promotor 5`/ Konz: 100µM / Invitrogen) wurden dann mit 10x Hybridisierungspuffer und Wasser vermengt und für 5min bei 90°C im Heizblock inkubiert und dadurch hybridisiert. Die Temperatur wurde dann nach den 5 Minuten auf 90°C pro Minute um einen Grad heruntergefahren bis 45°C erreicht waren. Das dann fertige DNA-Template wurde dann

64 für die RNA-Synthese verwendet.

Die Synthese der RNA wurde mit Hilfe des TranskriptAid^TM T7 High Yield Transcription Kit von Thermo Fisher Scientific durchgeführt. Nach Vorgabe im Herstellerprotokoll wurden DEPC-behandeltes Wasser, TranscriptAid^TM Reaktionspuffer, die einzelnen Nukleotide (ATP/CTP/GTP/UTP), das hergestellte DNA-Template und TranscriptAid^TM Enzyme Mix miteinander vermengt und anschließend für 6-7 Stunden bei 37°C auf dem Schüttler (300rpm) inkubiert. Nach dieser Inkubationszeit, in der die RNA vollständig synthetisiert wurde, fügte man RNase freie DNase I zu dem Ansatz hinzu, um das noch enthaltene DNA-Template vollständig zu verdauen. Im folgenden Schritt ließ man dann den Ansatz über Mini Quick Spin Säulen laufen, um Verunreinigungen wie Salze oder einzelne Nukleotide zu entfernen. Diese Mini Quick Spin Säulen werden zunächst durch eine zwei minütige Zentrifugation bei 1000g (RT) wurde die in den Säulen befindliche Flüssigkeit zunächst herausgewaschen. Die RNA-Lösung wurde nun auf die Säulen gegeben (max. 50µl pro Säule) und weitere 4 Minuten bei 1000g (RT) zentrifugiert. Nun erhielt man die reine RNA im Durchfluss, wohingegen unerwünschte Verunreinigungen in der Säule verblieben. Abschließend konnten dann die Konzentration und die Qualität der RNA, die wir auch 3pRNA oder IVT4 nennen, am Photometer (NanoDrop) bestimmt werden.

4.2.4.2 Polyacrylamid Gelelektrophorese

In dieser Arbeit wurde die Polyacrylamid-Gelelektrophorese verwendet, um RNA zum einen anhand ihrer Länge zu detektieren, aber auch, um eine vollständige Verkapselung durch das Transfektionsreagenz sicher stellen zu können.

Dazu wurde ein Gel an dem folgenden Ansatz hergestellt:

Substanz Menge

Acrylamid 7,5 ml

10x TBE 1,5 ml

Wasser (Ampuwa) 5,85 ml

10% APS 150 µl

TEMED 16 µl

Nach dem Start der Polymerisation durch die Zugabe des TEMED (N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin) wurde die Gellösung unverzüglich in die Kammer gegossen, den Taschenkamm eingefügt und 15 Minuten erkalten lassen. Die Taschen wurden mit 1x TBE-Lösung gespült, die Proben in die Taschen gefüllt und das Gel 1,5h bei einer Spannung von 200V unter Kühlung laufen lassen. Durch eine anschließende Sybr-Färbung konnte die Nukleinsäure dann sichtbar gemacht werden und mittels der ImageJ Software auch quantitativ bestimmt werden.

4.2.4.3 RNA Extraktion RNA Extraktion aus Zellen

Um Gesamt-RNA aus bestimmten Zielzellen zu isolieren wurden mindestens 6x10⁵ Zellen, maximal 4x10⁶ Zellen in 350µl RLT-Puffer (Hersteller: Quiagen) aufgenommen. Wurden mehr als 4x10⁶ Zellen verwendet, wurde die RLT-Puffer Menge verdoppelt. Nachdem die Zellen für mindestens 30min bei -80°C gelagert wurden, wurden sie mit 350µl bzw. 700µl 70% Ethanol versetzt, gut

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resuspendiert und anschließend maximal 800µl des Zelllysats auf eine RNA-Säule (Zymo IIIC Säule; Zymo Research) gegeben, die zuvor beschriftet wurden. Diese RNA-Säulen wurden dann in 2ml-Eppendorfgefäße gestellt und bei Raumtemperatur eine Minute bei 10.000rpm zentrifugiert.

Das Filtrat wurde verworfen, die Säulen auf neue, saubere 2ml-Eppendorfgefäße gesteckt und mit 350µl Quiagen RW1 Waschpuffer befüllt. Das Lysat wurde erneut zentrifugiert (10.000rpm/RT/1min), anschließend mit 350µl Zymo RNA Wasch Puffer (Hersteller: Zymo Research) versetzt und durch einen wiederholten Zentrifugationsschritt (10.000rpm/RT/1min) vom restlichen Ethanol befreit. Um eventuell vorhandene DNA-Fragmente aus der Gesamt-RNA zu entfernen, wurde das Lysat einem DNaseI-Verdau unterzogen. Hierzu wurde ein DNaseI Ansatzes nach Herstelleranweisung (Fermentas) hergestellt:

Substanz Hersteller Menge

pro Probe

DNaseI Fermentas 5U (= 5µl)

10x DNase Reaktionspuffer Fermentas 8µl

DNase / RNase freies Wasser Fermentas 3µl Zymo RNA Wasch Puffer Zymo Research 64µl

Gesamt: 80µl

Nach einer 30-minütigen Inkubation mit 80µl dieses DNaseI Ansatzes wurden die Proben erneut zentrifugiert (10.000rpm/RT/30sec) und mit 700µl Zymo RNA Wasch Puffer gewaschen. Dann folgte die Elution der RNA aus der Säule mittels einer kurzen (2min) Inkubation mit DNase / RNase freiem Wasser. Die gewonnene RNA wurde dann mit einen Spektralphotometer quantitativ bestimmt.

RNA Extraktion aus Gewebematerial

In dieser Arbeit wurde oft auch die Gesamt-RNA aus Gewebematerial benötigt. Hauptsächlich wurde die RNA aus verschiedenen Organen (Lunge, Leber, Niere, Milz, Gehirn) oder aus Tumorgewebe extrahiert. Dazu musste das aus dem Tier (Maus) gewonnene Organ bzw.

Gewebematerial unverzüglich in Kryogefäßen verschlossen auf Trockeneis gelegt werden. 20 - 30mg dieses Probenmaterials wurde dann mit einem Skalpell abgetrennt, in ein mit Zirkonium Beads befülltes 1,5ml-Reagenzgefäß gegeben und sofort mit 350µl RLT/ß-Marcaptoethanol-Puffer versetzt. Dieser Probenansatz wurde dann zweimal für 30 Sekunden homogenisiert (Precellys Homogenisator) und anschließend mit 350µl 70%igem Ethanol resuspendiert. Das dann anschließende Verfahren ist identisch mit dem RNA Extraktion Verfahren aus Zellen.

4.2.4.4 Spektralphotometrische Bestimmung von Nukleinsäurekonzentrationen Um die Konzentration von Nukleinsäuren spektralphotometrisch zu bestimmen wurde die Dichte bei λ = 260nm (OD260) gemessen, welches das Absorptionsmaximum für Nukleinsäuren darstellt.

Da eine OD260 = 1 47µg/ml DNA, bzw. 40µg/ml RNA entspricht, ergeben sich hieraus die Extinktionskoeffizienten [ԑ] von 47 für DNA bzw. 40 für RNA. Mit Hilfe der Lambert-Beerschen Formel konnte dann die Konzentration [c] folgendermaßen berechnet werden:

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c (µg/ml) = OD260 x ԑ x Verdünnungsfaktor

Da aber auch die Reinheit der Nukleinsäuren von entscheidender Bedeutung ist, wurde auch die Konzentration von Proteinen in der Lösung bestimmt. Hierzu wurde die Absorption bei λ = 280nm (OD280) gemessen, welches das Absorptionsmaximum von Proteinen darstellt.

Setzt man nun die beiden Absorptionsmaxima in Bezug zueinander (OD260 / OD280) so erhält man eine Aussage über den Grad der an kontaminierenden Proteinen in der analysierten Probe. Als reine DNA Probe bezeichnet man Lösungen mit einem Verhältnis (OD260 / OD280) = 1,8. Reine RNA Probe sollten ein (OD260 / OD280) Verhältnis von 2,0 ausweisen.

Für die Konzentrationsmessung meiner Proben wurde ca. 1µl Nukleinsäurematerial auf die Detektionslinse des Spektralphotometers pipettiert, vorsichtig verschlossen und die Absorptionsmessung bei OD260 und OD280 gestartet. Das Gerät gab dann zeitgleich die ermittelte Konzentration in ng/µl an, sowie auch die Reinheit in Form des Quotienten aus OD260 und OD280.

4.2.4.5 Quantitative PCR (qPCR)

Die quantitative Polymerasekettenreaktion, kurz qPCR (quantitative polymerase chain reaction) ist eine vielfältig einsetzbare Methode, die auf dem Prinzip der herkömmlichen PCR beruht, es aber zusätzlich ermöglicht, die Menge an produzierter mRNA für ein ganz bestimmtes Zielprotein quantitativ zu ermitteln. Um das zu ermöglichen wird nach jedem Amplifikationszyklus mit Hilfe eines Fluoreszenzfarbstoffes die Menge an vorhandenem DNA-Doppelstrang bestimmt.

Zur Durchführung einer qPCR wird zunächst die DNA benötigt, die den zu vervielfältigenden Bereich, das sogenannte DNA-Template, enthält. Um auf beiden Einzelsträngen dieser DNA den Startpunkt für die DNA-Synthese zu definieren und somit das DNA-Template einzugrenzen, werden synthetisch hergestellte einzelsträngige Oligonukleotide, sogenannte „Primer“, benötigt.

Der weitere Einsatz einer hitzestabilen DNA-Polymerase und einzubauender ODNs ermöglicht dann die gezielte Replikation des gewünschten DNA-Fragment, welche durch mehrfache Zyklus-Wiederholungen exponentiell verläuft. Der eingesetzte Fluoreszenzfarbstoff (hier: Sybr Green I) besitzt die Eigenschaft mit dsDNA zu interkalieren und auch dann erst zu einer starken Fluoreszenzemission zu führen. Frei in Lösung oder nur unter Anwesenheit von ssDNA ist diese Fluoreszenz-Emission nur äußerst schwach ausgeprägt. Das bedeutet, dass proportional mit der Menge der neu synthetisierten dsDNA PCR-Produkte, auch die Fluoreszenzintensität stark zunimmt. So kann am Ende eines Laufs anhand der erhaltenen Fluoreszenzsignale die Quantifizierung in der exponentiellen Phase der PCR vorgenommen werden.

Zur Bestimmung der mRNA Expression wurde zunächst die gesamt RNA aus den Zielzellen oder aus Gewebematerial extrahiert (siehe Beschreibung oben). Zur Durchführung einer reversen Transkription, bei der die gewonnene RNA von einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase in DNA umgeschrieben wird, wurde das SuperScript VILO cDNA Synthese-Kit der Firma Fermentas verwendet und das Protokoll nach Herstellerangaben befolgt

Die fertige cDNA wurde dann 1:5 mit RNase/DNase freiem Wasser verdünnt, bevor sie dann im Applied Biosystems 7500 Real-time PCR System quantifiziert wurde. Alle Quantifizierungen wurden in einem 96 Plattenformat durchgeführt und immer relativ zu einem unbeteiligten

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Zellprotein (housekeeping gene; meist ßActin oder TBP) gesetzt. Für eine 96-well Platte galten pro well die folgenden Mengenangaben und da pPCR Laufprotokoll:

Die Auswahl und das Design der von mir verwendeten Primer wurde mit Hilfe des Online Forums Universal ProbeLibrary Assay Design Center der Firma Roche durchgeführt. Die Effizienzkorrektur der jeweils verwendeten Primerpaare wurde vor dessen Einsatz experimentell ermittelt und in die Auswertung mit einbezogen. Die Quantifizierung der gesuchten Genexpression im Verhältnis zum eingesetzten Referenzgen wurde erfolgte schließlich anhand des Auswerteformates qgene96 unter Verwendung der folgenden Formel (Formel 1).

Formel 1: Berechnung der relativen Expression (A) und des Standardfehlers (B):

Berechnung der relativen Expression MNE (mean normalized expression):

Berechnung des Standardfehlers (Δx):