Molekularbiologische Methoden

Bestimmung der Nukleinsäure-Konzentrationen

Die Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren erfolgte in einem UV-Spektrometer bei einer Wellenlänge von 260 nm. Die Konzentration der DNA bzw. RNA kann unter Berücksichtigung der Verdünnung aus der gemessenen OD berechnet werden.

Es gilt: 1 OD260nm entspricht 50 µg/µl doppelsträngiger DNA bzw. 40 µg/µl einzelsträngiger DNA oder RNA. Um die Reinheit der Nukleinsäuren zu bestimmen, wurde zusätzlich die

2.2.5.2

2.2.5.3

optische Dichte der Proben bei einer Wellenlänge von 280 nm (Protein-Absorptionsmaximum) gemessen.

Behandlung von DNA mit Restriktionsendonukleasen

Die Behandlung von DNA mittels Restriktionsendonukleasen erfolgte nach den Vorgaben des Herstellers in 20 µl Ansätzen.

Polymerasekettenreaktion (PCR)

2.2.5.3.1 PCR mit AmpliTaqGold™ DNA Polymerase

Zur Amplifikation spezifischer DNA-Abschnitte mittels Polymerasekettenreaktion wurde die

„hot start“ DNA-Polymerase AmpliTaqGold™ verwendet und der folgende Ansatz pipettiert:

AmpliTaqGold™ 0,5 µl 1 U

Matrize (cDNA oder genomische DNA) 40-500 ng

dNTPs (je 10 mM) 0,5 µl 200 µM

5’-Primer (5 µM) 1,0 µl 200 nM

3’-Primer (5 µM) 1,0 µl 200 nM

10 x PCR-Puffer (mit 15 mM MgCl2) 2,5 µl 1 x

ddH2O auf 25 µl

Die Amplifikation erfolgte im Thermocycler mit folgendem Programm:

1. 12 min 94 °C Aktivierung des Enzyms

2. 30 sec 94 °C Denaturierung der dsDNA

3. 30 sec Tabelle 9 Hybridisierung der Primer

4. 60 sec 72 °C Elongation der Primer durch die Polymerase 5. 10 min 72 °C Extension

6. ∞ 4 °C Abkühlung

Die Schritte 2 bis 4 wurden je nach zu amplifizierendem Produkt 36- bzw. 45-mal durchlaufen.

Tabelle 9: Hybridisierungstemperaturen (T_H) der verwendeten Primer

5’ und 3’ Primer TH [°C] PCR-Produkt-Länge

Verwendungszweck

Aldolase fwd/rev 56 °C 249 bp Sonde für Northern Blot,

Quantifizierung mittels real-time RT-PCR

MDR1 fwd/rev 58 °C 299 bp Sonde für Northern Blot,

Quantifizierung mittels real-time RT-PCR

OL381 fwd/rev 55 °C 397 / 686 bp Insertkontrolle

2.2.5.3.2 Real time-RT-PCR im LightCycler

Die LightCycler-Technologie bietet die Möglichkeit, aufgrund einer mitlaufenden Standardreihe mittels mathematischer Methoden auf die Ausgangsmolekülzahl in einer Probe für eine bestimmte Matrize zu schließen. Die PCR-Ansätze waren wie folgt zusammengesetzt:

ddH2O 18 µl

DNA Master SYBR Green I 2,0 µl 1 x

MgCl2 (25 mM) 2,4 µl 4 mM

5’-Primer (10 µM) 1,0 µl 500 nM

3’-Primer (10 µM) 1,0 µl 500 nM

cDNA 2,0 µl

Es wurde bei jedem Lauf eine Nullkontrolle (ddH2O) und eine Standardreihe bestehend aus 6 bis 8 Proben (10er Verdünnungsstufen) mitgeführt. Vor jeder Quantifizierung wurde der spezifische Meßpunkt der jeweiligen PCR anhand der Schmelzkurve eines Probelaufs bestimmt. Die Meßtemperatur (TMeß) wurde so ausgewählt, daß sie knapp vor dem Abschmelzen des PCR-Produkts lag. Bei dieser Temperatur liegen eventuell vorhandene Primer-Dimere bereits als DNA-Einzelstränge vor und gehen somit nicht in das Meßergebnis mit ein.

2.2.5.4

2.2.5.5

Aufreinigung von PCR-Produkten

Die Aufreinigung von PCR-Fragmenten erfolgte durch das Qiagen QIAquick PCR Purification Kit. Die Aufreinigung wurde mit der Zugabe von 5 Volumenteilen Puffer PB zu 1 Volumenteil PCR-Produkt begonnen. Dieses Gemisch wurde auf eine vorbereitete Qiagen-Säule gegeben und zur Bindung der DNA an die Qiagen-Säulenpartikel 1 min zentrifugiert. Nach dem Verwerfen des Durchflusses folgte ein Waschschritt mit 750 µl Puffer PE. Nach einer 2 × 1 minütigen Zentrifugation wurde die Säule auf ein neues 1,5 ml Eppendorf-Tube gesteckt und die DNA mit 30 µl ddH2O eluiert.

Agarose-Gelelektrophorese

Zur elektrophoretischen Auftrennung von DNA wurden horizontale Gelapparaturen (BioRad) verwendet. Die Gele wurden mit 1,0 % [w/v] Agarose in 1 × TAE Puffer gegossen und enthielten 0,2 µg/ml Ethidiumbromid. Vor dem Auftragen wurde die DNA mit 1/10 Volumenanteil Blue/Orange 6 x Loading Dye versetzt. Als Größenstandards wurde je nach aufzutrennender DNA eine 100 bp- oder eine 1 kb DNA-Marker verwendet. Die Elektrophorese selbst erfolgte in 1 × TAE Puffer bei einer Spannung von 80-90 V. Nach Beendigung der Elektrophorese wurden die DNA-Banden auf einem UV-Transilluminator bei 254 nm sichtbar gemacht und photographisch dokumentiert.

50 x TAE

EDTA 50 mM

Essigsäure 19 mM

Tris-Base 40 mM

pH 8,0

2.2.5.6 Präparative Isolierung von DNA-Fragmenten

Die DNA-Extraktion aus Agarosegelen erfolgte unter Zuhilfenahme des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen). Zuerst wurde die zu eluierende Bande mit einem Skalpell aus dem Agarosegel ausgeschnitten und gewogen. Zu je 100 mg Gel wurden 300 µl Puffer QG hinzugegeben und für 10 min unter Schütteln bei 50 °C bis zum vollständigen Lösen des Gelstücks inkubiert. Anschließend erfolgte die Beladung der vorbereiteten QIAquick Säule mit der Lösung und eine 1 minütige Zentrifugation. Die Säule wurde mit 500 µl Puffer QG

2.2.5.7

2.2.5.8

und 750 µl Puffer PE gewaschen, wobei die aufgefangene Flüssigkeit stets verworfen wurde.

Nach dem letzten Waschschritt erfolgte eine erneute Zentrifugation, um eine völlige Entfernung des mit Ethanol versetzten Puffers PE zu erreichen. Zur Elution der DNA wurden 30 µl Puffer EB auf die Säule gegeben und diese für 1 min bei RT inkubiert. Danach wurde die Säule in ein neues Reaktionsgefäß überführt und die Plasmid-DNA mittels Zentrifugation eluiert.

Automatische Sequenzierung

Die Sequenzierung erfolgte durch Herrn Dr. Martin Meixner am Institut für Genetik der Humboldt-Universität zu Berlin.

Die zu sequenzierende Plasmid-DNA wurde aufgereinigt und auf eine Konzentration von 100 ng/µl eingestellt. Die Sequenzierung selbst erfolgte unter Verwendung eines ABI-373 DNA Sequenzierungsautomaten und des ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit nach der ursprünglichen Kettenabbruchmethode von Sanger (Sanger et al., 1977). Die Termination erfolgte durch fluoreszenzmarkierte Didesoxynukleotide.

Isolierung von genomischer DNA

Zur Isolation von genomischer DNA mittels Wizard SV Genomic DNA Purification Kit wurden die Zellen bis zu einer Konfluenz von 80 % kultiviert, trypsiniert und in 1 x PBS gewaschen. Das daraus resultierende Zellpellet wurde in 500 µl Lysispuffer resuspendiert und anschließend auf eine Säule gebracht. Zur Bindung der DNA an die Matrix erfolgte eine 3 minütige Zentrifugation bei 13000 rpm. Der Durchfluß wurde verworfen und die Säule viermal mit dem alkoholhaltigen Waschpuffer gewaschen. Zum Trocknen der Säulenmatrix wurde diese nochmals für 2 min und 13000 rpm zentrifugiert. Die Elution der genomischen DNA erfolgte mit 250 µl nuklease-freiem Wasser. Zu dem Eluat wurden noch 2 µl RNase A hinzugegeben und die Proben bei -80 °C gelagert.

2.2.6.1

2.2.6.2