Molekularbiologische Methoden

2.2.1.1 Extraktion genomischer DNA

Die Isolierung der genomischen DNA der Fliegen erfolgte nach der so genannten

„Single-Fly“-DNA-Extraktionsmethode (Gloor et al. 1993). Mit einer mit 50 µl Squishing-Buffer gefüllten Pipettenspitze wurden zwei Fliegen in einem PCR-Reaktionsgefäß möglichst vollständig zerdrückt. Anschließend wurde der restliche Extraktionspuffer zugegeben und das Homogenisat 30 min bei 37 °C inkubiert.

Danach wurde die im Puffer enthaltene Proteinase K bei 95 °C für 5 min inaktiviert.

2.2.1.2 Sequenzierung

Sequenzierungen erfolgten bei der Firma Seqlab über den extendedHotShot-Sequenzierungsservice. Das DNA/Primer-Gemisch wurde nach Angaben des Dienstanbieters eingeschickt. Es konnten pro Ansatz ca. 800-1000bp sequenziert werden. Die Analyse der Sequenzen erfolgte mit dem Programm EditSeq.

2.2.1.3 Quantitative Real-Time-PCR RNA-Extraktion

Männliche sieben Tage alte Fliegen wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C bis zur Extraktion aufbewahrt. Die RNA-Extraktion erfolgte mit Hilfe des PeqGOLD TriFast™ Reagenz der Firma PeqLab laut Herstellerprotokoll. Es wurden jeweils zehn Fliegen in 1 ml Trifast-Puffer mit einem elektrischen Stößel homogenisiert. Das RNA-Pellet wurde in 30-50 µl H2ODEPC gelöst. Am Mikrovolumen-Spektrophotometer NanoDrop1000 erfolgte die Bestimmung der Konzentration und der Reinheit der RNA-Lösungen. Proben, die Werte außerhalb des zu erwarteten Bereiches zeigten, wurden verworfen.

Reverse Transkription

Herstellers angesetzt. Die Transkription erfolgte für 30 min bei 42 °C. Die anschließende Inaktivierung des Enzyms erfolgte für 5 min bei 95 °C. Die cDNA wurde bei -80 °C maximal einen Tag aufbewahrt.

semi-quantitative Real-Time-PCR und Auswertung

Die semi-quantitative real-time-PCR wurde mit dem Lightcycler™ System der Firma Roche bzw. dem MiniOpticon™System der Firma BioRad durchgeführt. Die PCR-Reaktionen wurden mit dem Quantitect SybrGreen Kit der Firma Qiagen bzw. dem iQ™ SYBR^® Green Supermix laut Protokoll angesetzt. Die Auswertung der Daten erfolgte über die ∆∆CT-Methode. Als interne Kontrolle wurde das housekeeping gene RP49 amplifiziert. Bei jedem Lauf wurde eine Leerprobe ohne DNA mitgeführt, um eventuelle Kontaminationen ausschließen zu können. Über die Analyse der Schmelzkurve der amplifizierten Produkte wurde die Reaktion auf Primerdimere und unspezifische Produkte überprüft. Es wurden pro Probe ein bis zwei biologische Wiederholungen mit jeweils drei technischen Replikaten angefertigt.

2.2.1.4 Hitzeschocktransformation

Hitzeschockkompetente Zellen wurden für ca. 10 min auf Eis aufgetaut. Danach wurden 0,5 µl der bereits hergestellten cDNA-Puast-Klone zu den Zellen gegeben und diese für 45 s auf 42 °C inkubiert. Anschließend hat man die Zellen für 2 min auf Eis ruhen lassen und dann 1,0 ml LB0-Medium zugegeben. Nach 20 min leichten Schüttelns der Zellen auf 37 °C wurden jeweils 100 µl unverdünnte sowie 1:2 verdünnte Zellsuspension auf LBAmp-Platten ausplattiert. Die Inkubation der Platten erfolgte für 10-16 Stunden auf 37 °C.

2.2.1.5 Mini-Präparation

Für die Minipräparation wurden je 3 ml LBAmp-Medium mit jeweils einem Retransformationsklon angeimpft. Die Flüssigkulturen wurden über Nacht bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Aus den angesetzten Kulturen wurde für die Mikroinjektion reine Plasmid-DNA über den QIAprep^®-Miniprep-Kit von Qiagen isoliert.

2.2.2 Proteine

2.2.2.1 Immunoblot-Verfahren Proteinextraktion

Es wurden männliche Fliegen sieben Tage gealtert und dann in flüssigem Stickstoff abgetötet und bei -80 °C eingefroren. Jeweils vier Fliegen pro Genotyp wurden in 100 µl PCB plus 2 µl DTT mit Hilfe eines elektrischen Stößels in 1,5 ml Reaktionsgefäßen homogenisiert. Anschließend wurden die Extrakte bei 4 °C und 14.000 rpm für 10 min zentrifugiert. Der abgenommene Überstand wurde dann zur vollständigen Aufreinigung ein weiteres Mal zentrifugiert. Das gewonnene Proteinextrakt wurde mit Proteinladepuffer versetzt und für fünf Minuten auf 95 °C erhitzt. Die Extrakte wurden entweder sofort auf das Gel geladen oder bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C eingefroren.

Protein-Gelelektrophorese

Für die quantitative Detektion von p150^Glued wurden Acetatgele angefertigt. Da die interne Kontrolle Aktin mit einer Größe von 46 kDa bedeutend kleiner ist als das Zielprotein p150^Glued (150 kDa) wurden einfache Gradientengele mit drei verschiedenen Schichten angefertigt. Die unterste Schicht enthielt 6 %, die mittlere 5 % Polyacrylamid. Diese beiden Schichten wurden jeweils zu zwei Fünftel des gesamten Gels aufgegossen. Die oberste Gelschicht (Sammelgel) hatte eine Konzentration von 4 % Acrylamid. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte bei 150 V für ca. vier bis fünf Stunden in einem speziellen Elektrophoresepuffer für Acetatgele (Tabelle 3, S.28).

Protein-Transfer

Die Proteine wurden über das so genannte Wet-Blot-Verfahren auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Das „Blotsandwich“ wurde vom negativen zum positiven Pol in folgender Reihenfolge aufgebaut: Schwamm, 2 Whatman-Papiere, Proteingel, Membran, 2 Whatman-Papiere, Schwamm.

Die Schwämme, Whatman-Papiere und die Membran wurden zuvor im Transferpuffer äquilibriert. Der Proteintransfer auf die Membran erfolgte für ca. 20 h bei 35 V.

Antikörperfärbung

Nach dem Protein-Transfer wurde die Membran für 10 min in TBS gewaschen.

Unspezifische Bindungsstellen der Membran wurden anschließend mit Blockierungspuffer für 1,5–2 h bei RT abgesättigt. Die Inkubation mit den primären Antikörpern erfolgte für 72 h bei 4 °C (Tabelle 10). Um die Antikörperbindung zu stabilisieren, wurde die Membran danach in der Antikörperlösung für ca. 1h auf RT aufgewärmt. Im Anschluss wurde die Antikörperlösung recycelt und die Membran wenigstens dreimal mit TBST unter leichtem Schütteln für mindestens 10 min gewaschen. Die Färbung mit dem sekundären Antikörper erfolgte lichtgeschützt bei RT für 2–3 h (Tabelle 10). Die Antikörperlösung wurde anschließend zurück gewonnen und die Membran wie oben beschrieben mit TBST gewaschen. Zum Schluss wurde die Membran für mindestens 5 min in TBS geschüttelt.

Primäre Antikörper Verdünnung Sekundäre Antikörper Verdünnung

anti-Flag^® M2 1:200 GAM-680 1:3000

anti-actin AA20-33 1:3000 DAR-800 1:3000

Tabelle 10: Antikörperlösungen für p150^Glued-Western-Blots.

Detektion und Quantifizierung

Die Fluorophore der sekundären Antikörper auf der Membran wurden mit dem Infrarotscanner Odyssey der Firma Li-Cor bei 700 und 800 nm angeregt. Die Intensität der Infrarotfluoreszenz in den jeweiligen Wellenlängenbereichen wurde aufgezeichnet und gespeichert. Um die relative Proteinexpression quantifizieren zu können, wurde für das Zielprotein p150^Glued als auch für die interne Kontrolle Aktin die Integrated Intensity bestimmt. Der Quotient aus den beiden Werten gibt die relative Proteinmenge des untersuchten Proteins im Verhältnis zur internen Kontrolle innerhalb einer Einzelprobe wieder.