3 Material und Methoden
3.3 Methoden
3.3.1 Molekularbiologische Methoden
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41 3.3.1.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Für PCR-Reaktionen wurde die Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µl) (Thermo Scientific) eingesetzt. Der verwendete Puffer war der Phusion HF 2 x Mastermix (Thermo Scientific). Er enthält 3 mM MgCl2 und 400 µM von jedem dNTP.
Die einzelnen Komponenten sind in der Reihenfolge der Zugabe aufgelistet:
Tabelle 3-20: PCR-Ansatz
10 µl Phusion HF 2 x Mastermix 1 µl Primer 1 (10 µM)
1 µl Primer 2 (10 µM) 1 µl Templat (1 ng/µl) 0.4 µl DMSO
6.4 µl bidest. Wasser 0.5 µl Phusion-Polymerase
20 µl
Für PCRs wurde der TProfessional™ Thermocycler der Firma Biometra verwendet. Das verwendete Temperaturprogramm ergibt sich aus Tabelle 3-21.
Tabelle 3-21: Temperaturprogramm für die PCR
30 Wiederholungen 1. 98 °C 30 s Initiale Denaturierung
2. 98 °C 10 s Denaturierung
3. 64 °C 20 s Annealing (Anlagerung) 4. 72 °C 15 s Elongation
5. 72 °C 5 min Terminale Elongation 6. 4 °C ∞ Lagerung
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Die verwendeten Primer wurden von der Firma Invitrogen synthetisiert und gereinigt. Die DNA-Sequenzen sind in Tabelle 3-22 aufgelistet.
Tabelle 3-22: PCR-Primer
Name Sequenz (5’-3’)
monBI_NcoI_fwd GCC CAT GGG CAT GAA CGA GTT CGC CCG CAA GAA GCG monBI_Stop
_BamHI_rev GCG CGG ATC CTC AGC CGA GGA CCG TGA GAT CGG ATG monBII_BspHI_fwd GCC GTC ATG AGC ATG CCC GAC GAG GCC GCG CGC monBII_ohneCTerm
_Stop_BamHI GCG CGG ATC CTC AGG TCA CGT CCG TGA CGC CCC AG monBII_monBI
_linker_fwd CCC ACC CCG AAG GGA TAC GCG CGA TGA ACG AGT TCG CCC GCA AGA AGC monBII_monBI
_linker_rev GCT TCT TGC GGG CGA ACT CGT TCA TCG CGC GTA TCC CTT CGG GG 3.3.1.5 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen
Die DNA wurde zu analytischen und präparativen Zwecken mit sequenzspezifischen Restriktionsendonukleasen geschnitten. Die verwendeten Enzyme und Puffer stammten von der Firma Thermo Scientific. Es wurden die vom Hersteller empfohlenen Puffer und Reaktionsbedingungen angewandt.
3.3.1.6 DpnI-Verdau
Um das PCR-Templat abzubauen, erfolgte im Anschluss an die PCR ein Restriktionsverdau mit DpnI.
Tabelle 3-23: Reaktionsansatz für den DpnI-Verdau nach einer PCR
20 µl PCR-Produkt
5 µl 10 x Tango Puffer (Thermo Scientific) 23 µl bidest Wasser
2 µl DpnI (10 U/µl)
Mit bidest. Wasser auf 50 µl auffüllen
Das Restriktionsenzym erkennt die Sequenz GATC, wenn bei dieser Adenin methyliert ist.
Der DpnI-Verdau des PCR-Ansatzes wurde für 60 min bei 37 °C und 300 rpm inkubiert. Anschließend wurde das Enzym durch Inkubation des Ansatzes bei 80 °C für 20 min inaktiviert.
43 3.3.1.7 Analytischer Restriktionsverdau
Zur Überprüfung von Ligationen wurde ein Kontrollverdau durchgeführt. Es wurden zwei Restriktionsendonukleasen gewählt, die die DNA so verdauten, dass anhand der Größe der resultierenden DNA-Fragmente überprüft werden konnte, ob die Konstrukte korrekt kloniert wurden.
Tabelle 3-24: Reaktionsansatz für einen analytischen Restriktionsverdau
0.5 – 1 µg DNA
2 µl 10 x Restriktionspuffer 0.5 – 1 µl Enzym 1
0.5 – 1 µl Enzym 2
Mit bidest. Wasser auf 20 µl auffüllen
Die Zusammensetzung des Reaktionsansatzes ergibt sich aus Tabelle 3-24. Er wurde für 60 min bei 37 °C und 400 rpm inkubiert und anschließend mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert.
3.3.1.8 Präparativer Restriktionsverdau
Zur Vorbereitung der Ligation von DNA-Fragmenten in Vektorfragmente zur Produktion neuer Plasmide wurden sowohl die Fragmente als auch die Vektoren mit Restriktionsendonukleasen geschnitten. So wurden komplementäre DNA-Enden für die Ligation erzeugt.
Der Verdau von PCR-Produkten erfolgte direkt nach dem DpnI-Verdau. Dazu wurden 1 bis 2 µl jeder Restriktionsendonuklease direkt zum DpnI-Verdau-Ansatz hinzugegeben.
Für den Verdau des Vektors wurde der folgende Ansatz verwendet:
Tabelle 3-25: Reaktionsansatz für einen präparativen Restriktionsverdau
2-5 µg Plasmid-DNA
5 µl 10 x Restriktionspuffer 2 µl Enzym 1
2 µl Enzym 2
Mit bidest. Wasser auf 50 µl auffüllen
Vor der Zugabe der Restriktionsenzyme wurden die restlichen Komponenten des Ansatzes für 10 min bei 95 °C inkubiert, um DNasen zu inaktivieren.
44 3.3.1.9 Dephosphorylierung von Vektor-DNA
Bei diesem Verfahren werden Phosphat-Reste am 5‘-Ende von DNA-Molekülen, die bei der restriktionsenzymatischen Spaltung entstehen, durch eine alkalische Phosphatase entfernt. Dadurch wird die Zirkularisierung von Vektor-DNA bei der Ligation verhindert und die Klonierungseffizienz erhöht. Zur Dephosphorylierung der Vektor-DNA wurde die FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µl) der Firma Thermo Scientific verwendet.
Tabelle 3-26: Reaktionsansatz für die Dephosphorylierung von Vektor-DNA
1 – 2 µg linearisierte Vektor-DNA 2 µl 10 x FastAP Puffer
1 µl FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µl) Mit bidest. Wasser auf 20 µl auffüllen
Die Dephosphorylierung erfolgte für 2 bis 12 h bei 37 °C und 400 rpm. Im Anschluss erfolgte eine Inaktivierung der Phosphatase durch Inkubation des Ansatzes bei 75 °C für 5 min.
3.3.1.10 Reinigung von PCR-Fragmenten
Die Reinigung von DNA aus PCR-Reaktionsansätzen erfolgte mittels Agarose-Gelelektrophorese und anschließender Extraktion mit dem GeneJET™ Gel Extraction Kit nach Angaben des Herstellers (Thermo Scientific). Die gereinigte DNA wurde in bidest. Wasser eluiert.
3.3.1.11 Ligation von DNA
Nach präparativem Restriktionsverdau und Aufreinigung über ein Agarosegel wurde zunächst eine Bestimmung der DNA-Konzentration von Vektor und Insert unter Verwendung des Nanodrop 1000 Spektrophotometers (Thermo Scientific) durchgeführt.
Die Ligation von linearisierter Vektor-DNA mit einem 2 bis 3-fachen molaren Überschuss von DNA-Fragmenten erfolgte unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (Thermo Scientific).
Die benötigten Vektor- und Insert-Mengen wurde mit dem Ligationsrechner der Universität Düsseldorf berechnet110.
Tabelle 3-27: Ligationsansatz
50 – 100 ng lineare Vektor-DNA 100 – 300 ng Insert
2 µl 10 x T4 DNA-Ligase-Puffer 1 µl T4 DNA-Ligase
Mit bidest. Wasser auf 20 µl auffüllen
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Die Inkubation der Ligationsansätze erfolgte über Nacht bei 16 °C. Zur Inaktivierung der T4 DNA-Ligase nach der Reaktion wurde der Ligationsansatz für 5 min bei 80 °C inkubiert. Anschließend erfolgte die Transformation in chemisch kompetente E. coli Top10™ oder E. coli DH5α™ (siehe 3.3.1.14).
3.3.1.12 Sequenzierungen
Neu klonierte Plasmide wurden nach der Validierung durch einen analytischen Restriktionsverdau zusätzlich mittels Sanger-Sequenzierung überprüft. Es wurden nur die Gen-Fragmente (Inserts) sequenziert. Die Proben wurden für die Sequenzierungen zu der Firma LGC Genomics geschickt und es wurden die Sequenzierprimer von LGC Genomics verwendet.
Tabelle 3-28: Primer für die Sequenzierung
Name Sequenz (5‘ – 3‘)
Forward-Primer T7prom TAATACGACTCACTATAGG
Reverse-Primer T7term GCTAGTTATTGCTCAGCGG
Die Konzentration der eingeschickten Proben lag bei 100 ng/µl in bidest. Wasser. Pro Sequenzierung wurden 4 µL Probe benötigt, die minimal benötigte Menge lag bei 15 µL. Die Analyse der Daten erfolgte mit dem Programm Chromas Lite (Technelysium).
3.3.1.13 Herstellung chemisch kompetenter E. coli-Zellen
Chemisch kompetente E. coli-Zellen wurden mit dem Kit von Zymo Research nach den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Für die Übernachtkulturen wurde Super Optimal Broth (SOB) anstelle von ZymoBroth™ verwendet.
3.3.1.14 Transformation durch Hitzeschock
100 µl-Aliquots kompetenter E. coli-Zellen wurden auf Eis aufgetaut, 1-10 µl Plasmid-DNA oder Ligationsansatz zugegeben und weitere 30 min auf Eis inkubiert. Die Transformation erfolgte durch einen Hitzeschock für 45 s bei 42 °C. Anschließend wurde für 5 min auf Eis inkubiert, 1 ml SOC- (Super Optimal Broth with Catabolic Repression-) Medium zugegeben und die Zellen 1 h bei 37 °C angezogen. 50-100 µl Zellsuspension wurden auf Agarplatten mit LB-Selektivmedium ausplattiert und über Nacht bei 37 °C kultiviert.
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