Molekularbiologische Methoden

2.2.2.1 RNA-Isolierung aus adhärenten Zellen

Zunächst wurden die TNBC-Zelllinien wie in Kap. 2.2.1.1 beschrieben in Zellkulturflaschen ausgesät und nach Erreichen einer Konfluenz von ungefähr 80 % trypsiniert, zentrifugiert, in Versuchsmedium resuspendiert und mithilfe der Neubauer-Zählkammer ausgezählt (siehe Kap. 2.2.1.3). Anschließend ist eine definierte Zellzahl der Suspension in 6-Well-Platten in Versuchsmedium ausgesät worden (siehe Tabelle 14). Bei ausreichender Zellkonfluenz in der Well-Platte, wurde das Versuchsmedium vorsichtig abgesaugt.

Anschließend sind die Zellen durch Inkubation mit einem Gemisch aus ß-Mercaptoethanol und RLT Puffer im Verhältnis 1:1000 direkt in der Well-Platte lysiert worden.

Die RNA-Isolierung ist mithilfe des RNeasy®Mini Kit der Firma Qiagen (Hilden) durchgeführt worden. Dieses Verfahren beinhaltet eine spezifische RNA-Bindung an eine Silika-Gel-Membran, eine Reinigung mittels mehrerer Waschschritte und RNA-Eluierung mit doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O). Die Zellaufarbeitung wurde gemäß Herstellerangaben ausgeführt. Im Anschluss wurden die Proben bei -80 °C gelagert.

2.2.2.2 Quantifizierung der RNA

Die Quantifizierung der RNA wurde mithilfe eines UV-Photometers durchgeführt. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte bei λ = 260 nm (A260). Bei dieser Wellenlänge haben Nukleinsäuren ihr Absorptionsmaximum. Proteine, die bei der Aufbereitung als Verunreinigungen auftreten besitzen hingegen ein Absorptionsmaximum bei λ = 280 nm (A₂₈₀). Somit spiegelt das Verhältnis der Extinktionen A₂₆₀ zu A₂₈₀ die Reinheit der

Nukleinsäureprobe wider. Das Verhältnis sollte sich im Bereich zwischen 1,8 und 2 befinden.

2.2.2.3 Reverse Transkription

Bei der Reverse Transkription (RT) wird RNA mittels einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase (Bestandteil von SuperScript™ II Reverse Transcriptase) in einen komplementären DNA-Strang (complementary desoxyribonucleic acid, cDNA) umgeschrieben. Die cDNA stellt die Grundlage für die Polymerase-Kettenreaktion dar.

Im ersten Schritt ist 1 µg RNA mit 12 µl destilliertem Wasser (dH2O) aufgefüllt worden.

Dazu wurde zusätzlich 1 µl DNAse I recombinant [10 U/µl] und 1 µl RNasin®plus RNase Inhibitor [40 U/µl] hinzugegeben. Anschließend wurde die Probe im Thermocycler für 30 min bei 37 °C und für 10 min bei 70 °C erhitzt und danach auf 4 °C herunter gekühlt.

Im Anschluss sind der Probe 26 µl des Enzym-Mix (siehe Tabelle 16) hinzugegeben worden. Danach erfolgte eine Erhitzung für 60 min auf 37 °C und dann eine Denaturierung für 10 min bei 95 °C. Zum Schluss wurde der Probenansatz wieder auf 4 °C herunter gekühlt und die entstandene cDNA bei -20 °C gelagert.

Substanzen Einsatz je

Probe [µl]

Ausgangskonzentration

dT15-Primer 8 1,1x 10 ^-5 M

dNTPs 4 0,01 M

FS-Puffer 8 5x

DTT 4 0,1 M

SuperScript™ II Reverse Transcriptase 2 200 U/µl

Tabelle 16 Substanzen für die Herstellung des Enzym-Mix für die Reverse Transkription

2.2.2.4 Polymerase-Kettenreaktion

Mithilfe der Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) ist es möglich gezielt bestimmte Sequenzen der DNA in vitro zu amplifizieren. Mittels einer DNA-abhängigen Polymerase und DNA-Oligonukleotiden (Primer) wird anhand der Nukleinsäure-Matritze ein komplementärer DNA-Strang erzeugt. Die PCR kann in drei Teilschritte unterteilt werden, die im Folgenden erläutert werden sollen.

Zuerst erfolgt die Erhitzung der doppelsträngigen DNA auf 95 °C, um die Stränge voneinander zu trennen. Bei diesem Prozess kommt es zum Aufbrechen der Wasserstoffbrückenbindungen (Denaturierung).

Material und Methoden 26

Danach wird eine Primer-spezifische Temperatur ausgewählt, welche eine Anlagerung der Primer an die komplementären Stränge der Matrizen-DNA ermöglicht. Dabei ist einer der Primer komplementär mit dem 5´-Ende der Matrize, der andere Primer komplementär zum 3´-Ende, sodass dazwischen ein definierter DNA-Abschnitt vorliegt (Annealing). Die spezifische Temperatur ist dabei durch die Sequenz und Länge der Primer definiert. Meist liegt sie unterhalb des Schmelzpunktes der Primer. Dies entspricht in der Regel einer Temperatur von 55 - 65 °C.

Beim dritten Schritt der PCR (DNA-Synthese) synthetisiert die DNA-Polymerase mithilfe von Desoxyribonukleosidtriphosphaten (dNTPs) den komplementären Strang zur Matrize (Elongation). Die DNA-Polymerase beginnt am freien 3´-OH-Ende des angelagerten Primers mit der Synthese in 5´-3´-Richtung. Die Elongation wurde bei 72°C durchgeführt, was dem Temperaturoptimum der Taq-Polymerase entspricht. Die Taq-Polymerase ist in der vorliegenden Arbeit als DNA-Polymerase verwendet worden und wurde aus dem thermostabilen Bakterium Thermus aquaticus (Taq.) isoliert. Nach der Elongation wurde der Reaktionsansatz auf 4 °C herunter gekühlt und die einzelnen Reaktionsschritte zyklisch wiederholt um eine exponentielle Amplifizierung der Matrize zu ermöglichen.

Als Kontrolle der semiquantitativen PCR-Methode diente die Amplifikation vom housekeeping gene L7, welches ein ribosomales, in allen Geweben exprimiertes Protein darstellt. Der in dieser Arbeit verwendete Standard-Reaktionsansatz für die PCR ist in Tabelle 17 und die PCR-Programme der jeweiligen zu untersuchenden Gene in Tabelle 18 zusammengefasst.

Substanzen Einsatz je Probe [µl] Ausgangskonzentration

DEPC H₂O 10,5

Sense-Primer 0,3 20 µM

Antisense-Primer 0,3 20 µM

Puffer 1,5 10x

dNTPs 1,2 1 mM

cDNA 1,2 10-100 ng/µl

Taq-Polymerase 0,075 5 U/µl

Gesamtvolumen 15

Tabelle 17 Substanzen für die Herstellung des PCR-Ansatzes

Gen Denaturierung Annealing Elongation Zyklen Target-Größe [bp]

ERα 15 sec, 95 °C 15 sec, 58 °C 5 sec, 72° C 30 215 ERß 15 sec, 95 °C 15 sec, 58 °C 5sec, 72 °C 35 393 L7 15 sec, 95 °C 15 sec, 54 °C 5 sec, 72 °C 22 357

Tabelle 18 PCR-Programme

2.2.2.5 Agarose-Gelelektrophorese

Mithilfe der Agarose-Gelelektrophorese können Nukleinsäuren anhand ihrer Größe aufgetrennt werden. Das Agarosegel hat dabei die Funktion eines Siebes. Mit zunehmender Agarose-Konzentration verkleinern sich die Poren des Gels, durch welche sich die Nukleinsäuren bewegen müssen. Das Wandern und Auftrennen der negativ geladenen Nukleinsäuren durch das Gel gelingt durch das Anlegen einer Gleichspannung. Dabei wandern kleinere Moleküle schneller als größere Moleküle, was eine Auftrennung der Nukleinsäuren anhand der Größe ermöglicht.

In dieser Arbeit sind 1,5 %-ige Agarose-Gele angefertigt worden. Hierfür sind 6 g Agarose mit 400 ml 1/2x TBE aufgekocht und im Anschluss 30 ml davon luftblasenfrei in eine Gelkammer mit eingestecktem Kamm gegossen worden. Nach erfolgter Aushärtung des Gels wurde die Kammer mit 1/2x TBE aufgefüllt und der Kamm herausgezogen. Es sind je 10 µl der Nukleinsäureproben mit 2 µl Agarose-Laufpuffer gemischt und anschließend 10 µl davon in die entstandenen Geltaschen pipettiert worden. Als Größenstandard diente ein DNA-Fragmentlängen-Standard (100 bp Ladder, Invitrogen). Im Anschluss liefen die Gele bei 95 V für durchschnittlich 45 min.

2.2.2.6 Auswertung

Nach der Auftrennung der DNA durch die Agarose-Gelelektrophorese erfolgte der Nachweis der Nukleinsäuren mithilfe des interkalierenden und fluoreszierenden Farbstoffs Ethidiumbromid. Die Gele sind dazu für 20 min im Ethidiumbromid-Bad gefärbt und in ddH2O gewaschen worden. Die zu detektierende Wellenlänge der UV-Strahlung liegt bei λ = 302 nm. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mithilfe der Software Bio Doc Analyze 2.1 von Biometra.