Molekularbiologische Methoden

4.1.1 Präparation von DNA

4.1.1.1 Reinigung von Plasmid-DNA aus E. coli und Y. enterocolitica

Zur Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli wurden verschiedene Kit-Systeme verwendet. Die Reinigung von Plasmid-DNA im Maßstab bis zu 10 µg aus 10 mL Bakterienkultur (Minipräparation) erfolgte mit Hilfe des QIAprep Spin MiniPrep Kit (Qiagen). Für die Isolierung großer Plasmidmengen, d.h. im Maßstab von 300-500 µg aus 100 mL Bakterienkultur, wurde das EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Hilden) verwendet. Es wurde nach den jeweiligen Anweisungen des Herstellers vorgegangen. Beide Systeme beruhen auf der alkalischen Lyse der Bakterienzellen und das unterschiedliche Verhalten von chromosomaler und Plasmid-DNA im alkalischen Milieu, die dadurch von der Plasmid- DNA getrennt werden kann.

4.1.1.2 Präparation von DNA-Fragmenten nach elektrophoretischer Auftrennung

Elektrophoretisch im Agarosegel getrennte DNA-Fragmente wurden unter UV-Licht als Block aus dem Gel ausgeschnitten und unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen, Hilden) gereinigt. Die Durchführung erfolgte nach den Angaben des Herstellers.

4.1.1.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA

Die photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA erfolgte bei einer Wellenlänge von λ=260 nm (Absorptionsmaximum).

Gemessen wurde in Quarzküvetten bei Verdünnung von 1:20-1:50. Als Nullwert wurde Ampuwa (Fresenius Kabi, Bad Homburg) bzw. der Elutionspuffer des zur DNA-Gewinnung verwendeten Kits gesetzt. Die Berechnung der DNA-Konzentration aus der ermittelten Absorption erfolgte nach dem Lambert-Beer’schen Gesetz.

Verunreinigungen der Probe durch Proteine konnten durch zusätzliche Absorptions-messung bei einer Wellenlänge von λ=280nm identifiziert werden. Der Quotient A260nm/A280nm verringert sich mit zunehmender Verunreinigung der Probe mit Proteinen und beträgt bei sehr reiner DNA annähernd 1,8.

Ausserdem wurde zur Konzentrationsbestimmung einer DNA- Lösung ein bestimmtes Volumen an Lösung im Agarosegel zusammen mit einer definierten DNA- Menge an Grössenstandard (1Kb Plus DNA Ladder, Invitrogen) aufgetrennt, mit Ethidiumbromid gefärbt und die Fluoreszenzintensität der zu untersuchenden Lösung mit der des Markers verglichen.

4.1.1.4 Agarose-Gelelektophorese

DNA-Fragmentgemische können durch Elektrophorese in Agarosegelen aufgetrennt werden. Dieser Vorgang ermöglicht die Analyse der Fragmentgröße mit Hilfe eines aufgetragenen Längenstandards sowie eine quantitative Bestimmung.

Für die analytische und präparative Auftrennung von DNA-Fragmenten wurden Agarose-Flachbettgele mit einer Agarosekonzentration von 0,7 bis 1,4 % eingesetzt.

Als Gel- und Laufpuffer diente 1x TAE-Puffer. Vor der Gelelektrophorese wurden die Proben ca. im Verhältnis 6:1 mit Auftragspuffer versetzt. Die Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgte bei einer Spannung von 90-120 V.

6x Auftragspuffer: 50 % (v/v) Glycerin; 0,1 mM EDTA; 0,25 % (w/v) Bromphenolblau; pH 7,0 10x TAE: 40 mM Tris/HCl, pH 8,0; 5 mM Essigsäure; 1 mM EDTA

4.1.2 Visualisierung von DNA

Nach der Gelelektrophorese wurden die aufgetrennten DNA-Banden im Agarosegel in einem Ethidiumbromidbad (1 µg/mL) für 10-20 min gefärbt und durch Fluoreszenzanregung mit UV-Licht (λ=260 nm) sichtbar gemacht. Die Dokumentation erfolgte mit einem UV- Transilluminatorsystem (BIO- RAD Laboratories, München, Deutschland)

4.1.2.1 Sequenzierung von DNA

Sequenzierungen wurden von der Firma GATC Biotech in Konstanz durchgeführt.

4.1.3 Enzymatische Behandlung von DNA

4.1.3.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Zur Amplifikation von DNA-Fragmenten für Klonierungs-, Mutagenese- oder Analysezwecke diente die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). DNA-Fragmente können in vitro durch thermostabile DNA-Polymerasen vervielfältigt werden.

Die Amplifikation erfolgt über zwei gegensätzlich orientierte Oligonukleotid- Primer.

Diese lagern sich an die denaturierten Einzelstränge der zu amplifizierenden DNA an und dienen der DNA-Polymerase als Ansatzstelle zur Synthese.

Für die Reaktion wurden standardmäßig jeweils 2 µM Oligonukleotid, 100 µM jedes dNTPs (Invitrogen) und 0,6 U Ampli Taq Gold DNA Polymerase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) eingesetzt. Als Matritze wurde entweder gereinigte Plasmid-DNA oder 5min in Ampuwa hitzepräparierte Bakterien herangezogen. Als Puffer diente der 10x PCR Buffer (Roche Diagnostics, Mannheim) .

Die Amplifikation der DNA-Fragmente wurde in automatisierten PCR-Prozessoren (T3 Thermocycler, Biometra) durchgeführt. Ein Zyklus umfasste 30-60 sec Denaturierung bei 94°C, 30-60 sec Anlagerung der Oligonukleotide bei den Primern angepasster Temperatur und abschließend 60-90 sec Extension bei 75°C. Insgesamt wurde dieser Zyklus 24-32x wiederholt. Zu Beginn der Amplifikation wurden 5 min Anfangsdenaturierung bzw. Aktivierung der AmpliTaq Gold Polymerase bei 94°C vorgeschaltet. Auf den letzten Zyklus folgten 7 min. Extension bei 75°C, um die Polymerisierung zu vervollständigen.

Der Erfolg der PCR wurde jeweils mittels Agarose-Gelelektrophorese überprüft.

4.1.3.2 Spaltung mit Restriktionsendonukleasen

DNA- Verdau mit Restriktionsenzymen erfolgte jeweils in dem vom Hersteller empfohlenen Puffer. Pro µg Plasmid-DNA wurden 2,5 U Enzym eingesetzt. Die Inkubation erfolgte 2 h bei 37°C für Plasmid-DNA und 6-16 h je nach Enzym für PCR- Produkten. Das Endvolumen des Reaktionsansatzes wurde so gewählt, dass die eingesetzte Enzymmenge 10 % des Gesamtvolumens nicht überschritt.

Mehrfachspaltungen wurden, soweit möglich, in einem Puffer durchgeführt. Waren die Puffersysteme zweier Restriktionsenzyme nicht kompatibel, erfolgte der Verdau zuerst in dem Puffersystem des schlechter spaltenden Enzyms (v.a. bei Plasmiden).

Anschließend wurde der Restriktionsansatz mittels PCR- Purification Kit (Quiagen) vom Puffer gereinigt und anschliessend der Zweitverdau im anderen Puffer durchgeführt.

Im Anschluss an die Restriktion wurde der vollständige Ansatz auf einem Agarosegel aufgetrennt. Das herausgeschnittene DNA-Fragment der korrekten Größe wurde nach der Gelelektrophorese als möglichst kleiner Gelblock aus dem Gel geschnitten und mittels Gel Extraction Kit (Quiagen) aus dem Gel extrahiert.

4.1.3.3 Ligation

Die Ligation von DNA-Fragmenten in Expressionsvektoren (pQE30, pcDNA3.1) wurde mit T4-DNA-Ligase (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) 16 h bei 18°C durchgeführt. Das Reaktionsvolumen wurde relativ klein (20 µL) gewählt. Das Insert-Fragment wurde im Überschuss zum Ligationsansatz gegeben (Insert: Vektor = 4:1), wobei 10 bis 50 ng Vektor-DNA eingesetzt wurden. Die DNA wurde mit 1 U T4-DNA-Ligase und 5x Ligationspuffer versetzt. Der Ansatz wurde mit DNase-freiem Aqua bidest. (Gibco) auf ein Endvolumen von 20 µL aufgefüllt.

Die Insert-Fragmente wurden über die Schnittstellen zweier verschiedener Restriktionsenzyme in die Vektoren ligiert. Dadurch konnte sowohl die Orientierung der Sequenz definiert als auch eine Selbstzirkularisierung des Vektors weitestgehend vermieden werden. Als Negativkontrolle diente ein Reaktionsansatz, der lediglich den geschnittenen Vektor enthielt.

Im Anschluss an die Ligationsreaktion wurde bei Verwendung Calcium- kompetenter E.coli der gesamte Ansatz, bei Verwendung elektrokompetenter E. coli nur 1/5 des Ligationsansatzes in die jeweiligen Zellen transformiert und auf Agarplatten mit dem jeweils dem Plasmid entsprechenden Antibiotikum ausplattiert. Als Beweis für einen erfolgreichen vollständigen Restriktionsverdau sollten nach Transformation der Negativkontrolle sehr wenige bis keine Klone wachsen.

4.1.3.4 Transformationskontrolle in E. coli mittels PCR

Der Erfolg einer Transformation wurde mittels der PCR überprüft. Dazu wurden die gewachsenen Klone gesichert und kleine Plasmidmengen mittels 5- minütiger Lyse durch Hitzeeinwirkung in je 50µl Ampuwa gewonnen. Das Lysat wurde kurz auf Eis abgekühlt und die Bakterien 2 min. bei 5000 U/min abzentrifugiert. 5 µL des Überstands wurden als DNA-Matrize in der PCR-Reaktion eingesetzt. Das Reaktionsvolumen betrug 50 µL, die Parameter entsprachen den oben beschriebenen.