2.3.1 Amplifikation von DNA-Fragmenten (Mullis & Faloona 1987; Saiki et al.
1988)
Die Polymerasekettenreaktion (Mullis & Faloona 1987; Saiki et al. 1988) ermöglicht die Vervielfältigung definierter DNA-Fragmente in vitro. Dies geschieht über zyklisches Wiederholen von Denaturierung der doppelsträngigen DNA, gefolgt von Anlagerung (Annealing) zweier Primer (synthetische Oligonukleotide, die das zu amplifizierende DNA-Fragment flankieren) und enzymatischer DNA-Synthese (Extension). Die Amplifikation von DNA-Fragmenten erfolgt exponentiell. Die Reaktion wurde in einem Volumen von 50-200 µl in einem Thermocycler (Deckeltemperatur 110 °C) durchgeführt. Die Reaktionen erfolgten mit je 5–100 ng zu amplifizierender DNA-Matrize, 0,025 U/µl GoTaq® DNA-Polymerase, 5×
Green GoTaq® Reaktionspuffer [(enthält 7,5 mM MgCl2 (Endkonzentration: 1,5 mM MgCl2) und Auftragspuffer)], je 0,2 mM dNTPs und jeweils 1 µM der beiden Primer. Zur fehlerfreien Amplifikation von DNA-Fragmenten für Klonierungen wurde zu diesem Ansatz noch 2,5 U Pwo-Polymerase zugegeben, da diese im Gegensatz zur Taq-Polymerase eine 3’ → 5’-Proofreading-Aktivität besitzt. Ein Standard PCR-Programm setzte sich wie folgt zusammen:
Schritt Temperatur [°C] Dauer
1. Denaturierung 95 5 min
2. Denaturierung 95 30 s
3. Primer-Anlagerung TA 30 s
4. Extension 72 1 min/kb
5. Finale Extension 72 10 min
Die Schritte 2 bis 4 wurden 32-mal wiederholt.
Aus der berechneten Schmelztemperatur der beiden Primer (Formel 2) wurde die optimale Anlagerungstemperatur TA nach Formel 3 ermittelt.
Formel 2: Berechnung der Schmelztemperatur eines Oligonukleotids.
TM: Schmelztemperatur des Primers °C
%GC: GC-Gehalt des Primers % n: Anzahl der Nukleotide des Primers
Formel 3: Berechnung der optimalen Anlagerungstemperatur der Primer in einer PCR-Reaktion.
TA: Annealing-Temperatur °C
TM1 & TM2: Schmelzpunkte der eingesetzten Primer
Die optimale Annealing-Temperatur wurde zum Teil auch experimentell bestimmt. Hierfür wurden mehrere PCR-Ansätze im Gradienten-Cycler (EPPENDORF Mastercycler gradients) parallel angesetzt. Mittels Agarosegelelektrophorese konnte anschließend ermittelt werden, welche Annealing-Temperatur die höchste Ausbeute an spezifischem Amplifikationsprodukt lieferte. Die Spanne des Gradienten lag zumeist im Bereich einer Anlagerungstemperatur zwischen 50 °C und 70 °C.
Führte eine PCR auch nach einem Gradienten nicht zu zufriedenstellenden Ergebnissen, wurde eine touchdown-PCR durchgeführt. Hierbei wurde die TA während der PCR schrittweise von 60 °C auf 45 °C erniedrigt:
Schritt Temperatur [°C] Dauer [min]
1. Denaturierung 95 5
2. Denaturierung 95 30 s
3. Primer-Anlagerung TA 30 s
4. Extension 72 1 min / kb
5. Finale Extension 72 10
7. Lagerung 16 ∞
Die Schritte 2 bis 4 wurden jeweils siebenmal mit TA = 60, 55, 50, 47 und 45 °C wiederholt.
Dieses Vorgehen kann hilfreich sein, wenn die beiden verwendeten Primer sehr unterschiedliche TM-Werte besitzen. Darüber hinaus wird durch die anfängliche hohe Anlagerungstemperatur die Spezifität der PCR-Amplifikation erhöht, während in den späten Runden eine große Menge an Produkt gebildet wird.
2.3.2 Kolonie-PCR
Zur Überprüfung der korrekten Insertion eines Gens in die multiple Klonierungsstelle eines Vektors wurde ein Insert-Screening mittels Kolonie-PCR durchgeführt. Dazu wurden auf Selektivplatten gewachsene Einzelkolonien dem PCR-Ansatz hinzugefügt und bei dem Denaturierungsschritt von 95 °C aufgeschlossen. Hierzu wurden die Zellen mit einer Pipettenspitze von der Platte gepickt und kurz auf dem Boden des PCR-Gefäßes verstrichen.
Die enthaltene DNA diente in den folgenden Amplifikationsrunden als Matrize. Als Primer wurden in der Regel genflankierende Plasmidprimer, Klonierungsprimer oder eine Mischung aus beiden eingesetzt. Das Volumen des Ansatzes betrug jeweils 20 µl. Im Ansatz waren je 0,25 U GoTaq® DNA-Polymerase, Green GoTaq® Reaktionspuffer, 0,1 mM dNTPs und je 0,5 µM der beiden Primer enthalten. Die Amplifikation erfolgte mittels Standard-Protokoll (siehe 2.3.1).
2.3.3 Megaprimer-PCR (Sarkar & Sommer, 1990)
Die Megaprimer-PCR ist eine Form der DNA-Manipulation mit der gerichtet Punktmutationen eingeführt werden können. In einer ersten PCR wird der Megaprimer hergestellt, indem mit Hilfe eines genflankierenden Primers und eines Primers, der die Mutation enthält, ein Fragment (der Megaprimer) amplifiziert wird. Je nach Lage der Mutation wird die Mutation über einen fehlerhaften 3‘-Primer in Kombination mit einem genflankierenden 5‘-Primer, oder über einen fehlerhaften 5‘-Primer in Kombination mit einem genflankierenden 3‘-Primer eingeführt. Der Megaprimer wurde mittels präparativer Gelelektrophorese gereinigt und diente zusammen mit dem das Gen auf der gegenüberliegenden Seite flankierenden Primer zur Amplifikation des gesamten Gens in einer zweiten PCR (Abbildung 4).
Abbildung 4: Prinzip der Megaprimer-PCR (modifiziert nach Seitz 2009).
Gezielte Mutationen werden im 1.Schritt durch zum Zielgen komplementäre fehlerhafte Primer eingeführt.
Die erste und zweite PCR wurden mittels Standardprotiokoll durchgeführt (siehe 2.3.1), wobei jedoch bei der Amplifikation des Volllängen-Zielgens die Dauer der Primer-Anlagerung auf 1 min erhöht wurde. Die optimale Primer-Anlagerungs-Temperatur des Megaprimers wurde wenn nötig experimentell ermittelt. Enthielt eine Zielsequenz mehrere Austausche, dann wurden diese entweder auf einem Mutationsprimer kombiniert oder durch mehrere Runden Megaprimer-PCR eingeführt, wobei immer mit dem kürzesten Megaprimer begonnen wurde.
Zur Klonierung von TrpGD-Mutanten wurde anstelle eines genflankierenden 3‘-Primers der auf den pET-Vektoren bindende T7-Terminator Primer verwendet. Damit konnte die XhoI-Schnittstelle (Ivens, 1996) zur Klonierung genutzt werden.
2.3.4 Agarosegelelektrophorese
Im Agarosegel werden DNA-Fragmente ihrer Länge entsprechend aufgetrennt. Durch Zugabe des DNA-interkalierenden Fluoreszenz-Farbstoffs Ethidiumbromid werden die Banden im Gel unter UV-Licht sichtbar (Sharp et al. 1973). Zur Herstellung eines Agarosegels wurde 1 % (w/v) Agarose in 0,5 % TBE-Puffer durch Aufkochen in einer Mikrowelle gelöst. Nach Abkühlen auf 50 – 60 °C wurden 0,2 µl der Ethidiumbromidstammlösung (10 mg/ml) pro ml Agarose hinzugegeben, die Lösung in eine Gelkammer gegossen und ein Taschenkamm eingesetzt, der nach dem Erstarren wieder entfernt wurde. Das fertige Gel wurde mit 0,5 % TBE-Puffer überschichtet. Die Proben wurden nun bei Bedarf mit 10 x DNA-Probenpuffer versetzt und in die Geltaschen pipettiert. Die Elektrophorese wurde bei 190 V für etwa 20 min durchgeführt. Die negativ geladene DNA wandert durch die angelegte
Spannung zur Anode, wobei verschieden lange DNA-Fragmente durch das Agarosenetz unterschiedlich stark gebremst werden.
Mit UV-Licht der Wellenlänge 302 nm wurden die DNA-Fragmente detektiert und mit Hilfe des Imager Multi-Doc-It Digital Imaging System die Gele dokumentiert. Als Größenstandard wurden 5 µl des GeneRuler™ 1 kb Plus DNA Ladder von Fermentas verwendet.
2.3.5 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Unter UV-Licht der Wellenlänge 302 nm wurden gewünschte Fragmentbanden mit einem Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten und in ein Reaktionsgefäß überführt. Die Extraktion der DNA erfolgte mit Hilfe des Nucleospin®II-Kits von Macherey-Nagel laut Anleitung des Herstellers. Die isolierte DNA wurde in 30 µl Wasser aufgenommen und bei -20 °C gelagert.