2.2.1 Standardmethoden der Molekularbiologie
Plasmid-DNA wurde mit dem Qiagen Mini Spin Kit oder dem Zippy DNA Extraktion Kit nach Herstellerangaben präpariert und anschließend mittels Absorptionsmessung bei 260 nm die Konzentration bestimmt. Dabei wurde zugrunde gelegt, dass die durchschnittliche Absorption von 50 µg doppelsträngiger DNA bei einer Wellenlänge von 260 nm einem Wert von 1 entspricht (Sambrook et al. 1989).
2.2.1.1 Agarose-Gelelektrophorese von Nukleinsäuren
Zur Trennung, Identifizierung und Reinigung von DNA-Fragmenten wurden 1-2%ige Agarosegele (w/v) mit 0,3 µg/ml (0,76 nM/ml) Ethidiumbromid in TAE (1 mM Essigsäure, 40 mM Tris pH 8,4, 1 mM NaEDTA) verwendet. Als Vergleichs-DNA wurde ein 100 bp DNA Marker oder 1 kb DNA-Marker (GeneRuler™) verwendet. Die Agarose-Gelelektrophorese wurde bei 5 V/cm in einer Horizontalgelapparatur durchgeführt. Die Gele wurden mittels eines Gel-Dokumentationssystems fotografiert. Für die Elution und Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurde das MiniElute Gelextraction Kit von Qiagen verwendet. Dazu wurde die DNA-Bande unter UV-Licht (λ=254 nm) aus dem Gel geschnitten, in ein Eppendorfgefäß überführt und entsprechend den Angaben des Herstellers verarbeitet. Die DNA wurde mit sterilem, HPLC reinem Wasser extrahiert.
2.2.1.2 Sequenzierung
Plasmide wurden mit dem Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit sequenziert. Die PCR wurde mit 200-400 ng Plasmid DNA mit 5x Sequenzierpuffer (Endkonzentration 80 mM Tris, 2 mM MgCl2 steril filtriert), 1 µM Oligonukleotide sowie 1 µl Big Dye Terminator Cycle Sequencing Reagenz in einem Volumen von 10 µl durchgeführt. Anschließend wurde der Sequenzieransatz mit 112,5 mM Natriumacetat pH 4,6 und 76% Ethanol (v/v) in HPLC reinem Wasser gefällt. Die DNA wurde mit 70% (v/v) Ethanol gewaschen. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet 20 min im Vakuumrotationsverdampfer getrocknet. Die Sequenzierung erfolgte durch das Sequenzierlabor am FMP bzw. durch Invitek GmbH (Berlin, Deutschland). Sequenzierprimer sind in Tab. 11 enthalten.
Tab. 11: Oligonukleotide zur Sequenzierung von Zonula Occludens-1
Die Nomenklatur der Primer setzt sich aus dem Proteinnamen und der ersten Base in der Sequenz im DKFZ Klon p686A1195Q mit der das Oligonuklotid beginnt, zusammen. Die Abkürzungen rv rückwärts (3´nach 5´) und fw vorwärts (5´nach 3´) stehen für die Sequenzierrichtung. Der T7 Promotorprimer bindet an den T7 Promotor in der Plasmidsequenz.
Bezeichnung Oligonukleotidsequenz von 5´nach 3´
Seq ZO1 429 rv gccgagggatagaagtgc
Seq ZO1 1434 rv cctaaaggagaagaagtgacc
Seq ZO1 1899 fw ggttcttcgagaagctgga
Seq ZO1 1935 rv gctggcaagagaagaacc
Seq ZO1 2444 fw cctacctgtcagctccagg
Seq ZO1 2958 fw gcgatacgaagatcgcg
Seq ZO1 3460 fw ccactgcctccacccc
Seq ZO1 3967 fw ggcgagaaacgctatg
Seq ZO1 4467 fw gcctcctgagtttgacag
T7 Promotor taatacgactcactataggg
2.2.1.3 Transfektion in Escherichia Coli
Zur Transfektion in unterschiedliche E. coli Stämme wurden elektrokompetente Bakterien, wie in Current Protocols in molecular biology (Ausubel et al. 2002) beschrieben, hergestellt. Die Transformation erfolgte im EasyjecT prima mit 1800 V in 1 mm Elektroporationsküvetten. Die Zellen wurden in 250 µl SOC Medium aufgenommen und 1 h bei 37°C geschüttelt. Anschließend wurden 50-100 µl der Zellsuspension auf Agarplatten mit dem entsprechenden Antibiotikum ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert.
2.2.1.4 Anlegen von Minikulturen
Eine Kolonie von einer Agarplatte wurde in 5-20 ml Luria Bertani (LB) Medium (1% (w/v) Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 85 mM NaCl) mit dem passenden Antibiotikum mit einem sterilen Zahnstocher überführt und über Nacht bei 37°C im Schüttler angezogen. Mit der Minikultur wurde entweder eine Kultur im Expressionsmaßstab inokuliert, eine Plasmidpräparation durchgeführt, oder eine Glycerinkultur angelegt. Die Tab. 12 enthält die Plasmide und die dazugehörige Antibiotikaresistenz sowie die Endkonzentration des Antibiotikums im Medium. Kulturen von E. coli OrigamiB(DE3)pLacI wurde zusätzlich 15 µg/ml Kanamycin zugesetzt.
Tab. 12: Plasmide und Antibiotikaresistenzen
Plasmid Antibiotikaresistenz Endkonzentration des
Antibiotikums im Medium
pMal-c2x Ampicillin 100 µg/ml
pTriEx-6 Ampicillin 50 µg/ml
pET-28a Kanamycin 30 µg/ml
pGex-4T-1 Ampicillin 100 µg/ml
2.2.1.5 Lagerung der Stämme
Bakterien aus einer Minikultur wurde 10% (v/v) autoklaviertes Glycerin beigemischt. Die Glycerinkultur wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C gelagert.
2.2.2 Erzeugung der Deletionsmutanten von Zonula Occludens-1
Die ZO-1 Abschnitte wurden durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit der BD Advantage 2 Polymerase Mix Polymerase erzeugt. Als Vorlage diente der Klon DKFZp686A1195Q2 vom deutschen Ressourcenzentrum für Genomforschung. Er kodiert für die humane α- Splicingvariante von ZO-1 und entstammt der Retina. Das PCR Programm ist in Tab. 13 angegeben.
Tab. 13: PCR Programm für die Amplifikation der Zonula Occludens-1 Abschnitte Temperatur Zeit in
Minuten Wiederholungen
94°C 05:00 1 Anfangsdenaturierung
94°C 00:40 27 Denaturierung
60°C 00:40 27 Oligonukleotidanlagerung
68°C
Im Ansatz waren enthalten: 1x BD Advantage 2 PCR-Puffer, 2 mM MgCl2, 80 ng Plasmid DNA, je 0,1 µM Oligonukleotide, 0,4 mM je dNTP und 1x Advantage 2 Polymerase Mix Polymerase in ddH2O.
Zur Generierung neuer Deletionsmutanten von ZO-1 wurde das ligaseunabhängige Klonierungssystem pTriEx-6 3C/LIC verwendet. Die Klonierung resultierte in Deletionsmutanten die N-terminal ein Strep-tag II und C-terminal ein His-tag kodierten. Durch ein zusätzliches Stoppkodon im Oligonukleotid entstanden auch Deletionsmutanten ohne His-tag. Die Klonierung wurde nach den Angaben des Herstellers (Novagen TB453) mit jeweils der Hälfte des empfohlenen Materials durchgeführt. Alle erzeugten Deletionsmutanten und Oligonukleotide sind in Tab. 14 zusammengefasst. Die Plasmide lagen anschließend im E. coli Stamm Nova Blue GigaSingle vor.
Tab. 14: Oligonukleotide für die Erzeugung neuer Zonula Occludens-1 Fragmente
Die Spalte 1 enthält die Benennung der ZO-1 Deletionsmutanten. In Spalte 2 sind die Namen der verwendeten Oligonukleotide aufgeführt. Die Oligonukleotidsequenz ist in Spalte 3 angegeben. Klein-geschriebene Buchstaben repräsentieren Basen die zu ZO-1 (DKFZp686A1195Q2) komplementär sind. Großgeschriebene Basen enthalten den Teil der komplementär zur Matrizen-DNA ist und ein eventuell eingefügtes Stoppcodon.
Domäne/
Name Bezeichnung Oligonukleotidsequenz von 5´nach 3´ AS bezogen auf DKFZp686A1195Q2
GGCACCAGAGCGTTTTActtcttccttc 22-114 ohne His•tag PDZ 1 PDZ1_Tri_f
Domäne/
Name
Bezeichnung Oligonukleotidsequenz von 5´nach 3´ AS bezogen auf DKFZp686A1195Q2
GGCACCAGAGCGTTTTAatccttcttcttctgagc 22-509 ohne His-tag PDZ
Um Aminosäuren in der PDZ 1 oder PDZ 2-Domäne auszutauschen, wurde eine modifizierte Quick-change Mutagenese (Stratagene, Amsterdam, Niederlande) durchgeführt.
Tab. 15: Zusammensetzung des Mutageneseansatzes Menge Zusammensetzung
0,5 μl Plasmid-DNA (60 ng) 1,5 μl 10x PCR-Reaktionspuffer 1,9 μl Primer (vor- oder rückwärts) 0,3 μl dNTPs
10,5 μl H2O (HPLC rein)
0,3 μl AdvantageTM 2 Polymerase 15,0 μl Gesamtvolumen
Mittels eines komplementären Primerpaares (Tab. 17) welches die gewünschte Mutation enthielt und ansonsten mit der Sequenz der PDZ-Domäne hybridisierte, wurde ein Basenaustausch eingeführt. In der PCR wurde das gesamte Plasmid inklusive der veränderten Sequenz im Anschluss amplifiziert (Tab. 16). Als Grundlage dienten die Plasmide pTriEx6 mit PDZ 1_D und PDZ 2_I. Der Ansatz ist Tab.
15 zu entnehmen. Im Syntheseschritt 1 wurde nur ein Primer zu dem Plasmid gegeben und fünf
Zyklen lang amplifiziert. Danach wurden die Ansätze vereinigt und 0,3 µl Polymerase zugegeben. Der Ansatz mit beiden Primern wurde weitere 17 Zyklen amplifiziert. Die aus Bakterien stammende unmodifizierte Plasmidvorlage lag methyliert vor. Diese Modifikation wurde ausgenutzt, um mit dem Enzym DpnI, welches methylierte DNA verdaut, die Vorlagen DNA abzubauen. Der Verdau erfolgte mit 10 U DpnI für 16 h bei 37°C. 3 µl der Ansätze wurden in 50 µl E. coli DH5α transformiert (s.2.2.1.3).
Tab. 16: Polymerasekettenreaktionsprogramm für die ortsspezifische Mutagenese
Im ersten Syntheseschritt wurde das Plasmid mit einem der beiden komplementären Primer amplifiziert. Für den zweiten Syntheseschritt wurden Ansätze mit komplementären Primern vereinigt.
Zyklenzahl Temperatur Zeit
Tab. 17: Oligonukleotide zur Mutagenese der PDZ 1 und 2-Domäne
Der Name gibt durch den ersten Buchstaben die Aminosäure und durch die Zahl ihre Position in der ZO-1 Sequenz von Klon DKFZp686A1195Q2 an. Es folgt die Aminosäure, die substituiert wurde. Die veränderten Basenpaare in der Oligonukleotidsequenz sind kursiv gesetzt.
Name/ Mutation Name der Primer Oligonukleotidsequenz von 5´nach 3´
PDZ 2 H209G ZO-1 P2 H193G fw
ZO-1 P2 H193G rv ggtcttcgattggcaagcGGtatatttgttaagg ccttaacaaatataCCgcttgccaatcgaagacc PDZ 1 S102E P1_S102E_f
P1_S102E_r ttgctgttcagcaactaaggaaaGAGgggaaaaatgca tgcatttttcccCTCtttccttagttgctgaacagcaa
P1 T109E P1_T109E_f
P1_T109E_r agtgggaaaaatgcaaaaattGAAattagaaggaagaag cttcttccttctaatTTCaatttttgcatttttcccact
PDZ 2 T192E P2_T192E_f P2_T192E_r
cctgctaaacctactaaagtcGAActggtgaaatccc gggatttcaccagTTCgactttagtaggtttagcagg PDZ 2 Y202E P2_Y202E_f
P2_Y202E_r gaagaaGAGgtcttcgattggcaagcc ggcttgccaatcgaagacCTCttcttc PDZ 2 S208E P2_S208E_f
P2_S208E_r ggtcttcgattggcaGAGcatatatttgttaagg ccttaacaaatatatgCTCtgccaatcgaagacc PDZ 2 T239E P2_T239E_f
P2_T239E_r ggtgatgttgtattgaagataaatggtGAGgtgacag