3.2.1 PCR
L¨osungen eingesetzte Konzentration
10x PCR-/Pfu-Puffer 5µl
dNTPs 200µmol bzw. 10mM je Nukleotid
Oligonukleotid 1 0,1-1,0 0,1-1,0µM
Oligonukleotid 2 0,1-1,0 0,1-1,0µM
DNS Matritze 1µg
Polymerase 1U bzw. 1,25U
ddH2O ad 50µl
Tabelle 3.4: Verwendete PCR-Reagenzien sowie die eingesetzen Konzentrationen
L¨osungen
Durchf¨uhrung Die Amplifikation von DNS erfolgte in 50µl Ans¨atzen. Dazu wurden die in der Tab. 3.4, S. 76 aufgelisteten Reagenzien auf Eis zusammenpipettiert und die DNS je nach Anwendung entweder mit Hilfe der Taq- (Life Technologies), der Pfu- (Invitrogen) oder der PhusionTM Hot Start-Polymerase (Finnzymes Biolabs) vervielf¨altigt. Die Reaktionen wurden in MJ Research PTC-200 Thermocyclern durchgef¨uhrt. Bei Verwendung von Oligonukleotiden mit unterschiedlichen Schmelztemperaturen (Tm) erfolgte die PCR bei der niedrigeren Tm.
3.2.2 Aufreinigung von PCR-Produkten
(QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen)
L¨osungen
Puffer PBI gelb, pH</=7,5 Puffer PE
3.2 Molekularbiologische Methoden
Durchf¨uhrung F¨ur die Aufreinigung von PCR-Produkten wurde das QIAquick PCR Auf-reinigungskit von Qiagen verwendet und dabei gem¨aß des Protokolls mittels Mikrozentrifuge verfahren. Im Detail wurden zu einem Volumen des PCR-Ansatzes f¨unf Volumina des Puf-fers PBI gegeben, die Mischung auf die bereitgestellte S¨aule gegeben und diese f¨ur 1min bei 12000∗g und RT zentrifugiert. Der resultierende ¨Uberstand wurde verworfen, die Matrix mit 750µl des Puffers PE gewaschen und anschließend durch erneute Zentrifugation getrocknet.
Die Elution erfolgte mit 10µl dH2O.
3.2.3 Restriktionsverdau
(Sambrook & Gething, 1989)
Durchf¨uhrung Die Restriktion der DNS erfolgte unter den, von den Herstellern empfoh-lenen, Temperatur- und Pufferbedingungen. F¨ur analytische Zwecke wurde einem Reakti-onsansatz mit einem Endvolumen von 10µl nach Angaben des Herstellers proµg DNS 1U Restriktionsendonuklease und gegebenfalls 1µl 10x BSA (New England Biolabs, Frankfurt am Main) hinzugef¨ugt. Bei der Restriktion mit zwei verschiedenen Endonukleasen wurde der Puffer verwendet, in dem beide Enzyme nach Angaben des Herstellers mindestens eine Akti-vit¨at von 75% aufwiesen. Der Ansatz wurde f¨ur 1h bis 2h bei 37◦C inkubiert und anschließend gelelektrophoretisch aufgetrennt (Kap. 3.2.4, S. 77) und analysiert. Verwendete Restriktions-endonukleasen:
HindIII 10 U/µl
EcoRI 10 U/µl
NotI 10 U/µl
XhoI 10 U/µl
Die oben genannten Restriktionsendonukleasen wurden von der Firma New England Biolabs (Frankfurt am Main) bezogen.
3.2.4 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNS
(Sambrook & Gething, 1989)
L¨osungen
5x DNS-Probenpuffer 50% (v/v) Glycerin
1x Spatelspitze orange G, ad dH2O 50x TAE-Puffer 2M Tris-Acetat, pH8,0
100mM EDTA, ad dH2O
Durchf¨uhrung Die durch PCR-Reaktionen oder nach Restriktionsspaltungen erhaltenen DNS-Fragmente wurden zu analytischen Zwecken durch Elektrophorese in horizontalen 1-2%igen Agarosegelen (SubCellGT Elektrophoresekammern, BioRad, M¨unchen) aufgetrennt.
Die Herstellung der Agarosegele erfolgte durch L¨osung von 1% (w/v) Agarose in 1x TAE-Puffer. Die zu analysierenden Proben wurden mit 1/5 Volumen DNS-Probenpuffer versetzt und in die Geltaschen pipettiert sowie ein zus¨atzlicher Gr¨oßenmarker (DNA-Leiter 1kb, Gib-co BRL, Karlsruhe) zur Absch¨atzung der Molek¨ulgr¨oße. Die Elektrophorese wurde bei 100V durchgef¨uhrt. Nach Beendigung des Gellaufes wurde das Gel zur Sichtbarmachung der DNS in einer Ethidiumbromid-haltigen L¨osung (0,5g/ml in 1x TAE Puffer) f¨ur 30min gef¨arbt und mittels eines Imagesystems (E.A.S.Y. RH Imager, HERoLAB, Wiesloh) unter UV-Licht ana-lysiert.
3.2.5 Ligation von DNS
L¨osungen
Plasmid-DNS xmol
Insert-DNS 3x-6xmol
T4-Ligase 1U
10 x Ligasepuffer 1µl
ddH2O ad 10µl
Durchf¨uhrung F¨ur die Ligation wurde eine bestimmte Menge Plasmid-DNS mit einem drei-bis f¨unffachen ¨Uberschuss an Insert-DNS versetzt und mit den in L¨osungen genannten Rea-genzien auf Eis zusammenpipettiert. Die Reaktionszeit betrug 1-4h bei RT oder ¨uber Nacht bei 4◦C.
3.2 Molekularbiologische Methoden
3.2.6 Transformation von Bakterien
(Sambrook & Gething, 1989)
L¨osungen
LB-Medium Kap. 2.18, S. 44 LB-Agar Kap. 2.18, S. 44
Durchf¨uhrung Zur chemischen Transformation von Bakterien derE.coli-St¨amme DH5αund Top10 wurden 10ng - 100ng Plasmid-DNS mit 100µl einer Suspension der langsam aufgetauten chemokompetenten Bakterien gemischt und f¨ur 20min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Bakterien f¨ur 90s auf 42◦C erw¨armt und nach dem Hitzeschock wiederum f¨ur 2min auf Eis inkubiert. Der Ansatz wurde nach Zugabe von 800µl LB-Medium f¨ur 1h bei 37◦C inkubiert, kurz abzentrifugiert, 700µl des ¨Uberstandes verworfen und die Bakterien in den verbleibenden 200µl resuspendiert. Die L¨osung wurde in verschiedenen Verd¨unnungsstufen auf Selektivagar ausplattiert und bei 37◦C inkubiert.
3.2.7 Minipr¨aparation von Plasmid-DNS aus E.coli-Bakterienkulturen
(PureLinkT M Quick Plasmid Miniprep Kit)
L¨osungen
Resuspensionspuffer R3
Lysepuffer L7
Pr¨azipitationspuffer N4
Waschpuffer W10
W9 dH2O
Durchf¨uhrung Die Plasmidisolierung im analytischen Maßstab erfolgte aus 2ml ¨ uber-Nacht-Kulturen mit Hilfe des PureLinkT M Quick Plasmid Miniprep Kit (Invitrogen) nach Angaben des Herstellers. Im Detail wurden die Bakterien der ¨u.N.-Kultur durch Zentrifugation f¨ur 1min bei 12000 ∗ g und RT sedimentiert, in 250µl Resuspensionspuffer aufgenommen, 5min inkubiert und dann 250µl Lysepuffer zugegeben. Nach Addition von 350µl Pr¨azipitationpuffer erfolgte die Sedimentation der DNS durch 10min¨utiges zentrifugieren bei 12000∗g und RT.
Der resultierende ¨Uberstand wurde auf die bereitgestellte S¨aule geladen und der, nach einem weiteren Zentrifugationsschritt erhaltene, Durchlauf verworfen. In gleicher Weise wurde die Matrix der S¨aule mit den Waschpuffern W10 (500µl) und W9 (700µl) gewaschen, durch Zentrifugation getrocknet und die DNS schlussendlich mit 10µl-50µl dH2O eluiert.
3.2.8 Maxipr¨aparation von Plasmid-DNS aus E.coli-Bakterienkulturen
(QIAfilter Plasmid Maxi Kit, Qiagen)
L¨osungen
Resuspensionspuffer P1
Lysepuffer P2
Pr¨azipitationspuffer P3 Equilibrierungspuffer QBT
Waschpuffer QC
dH2O
Durchf¨uhrung Die Plasmidisolierung im pr¨aparativen Maßstab erfolgte aus 250ml - 500ml uber-Nacht-Kulturen mit Hilfe des Maxipr¨¨ aparationskits QIAfilter Plasmid Maxi Kit (Qia-gen, Hilden) nach Angaben des Herstellers. Im Detail wurden die Bakterien der ¨u.N.-Kultur durch 15min¨utige Zentrifugation bei 6000rpm und 4◦C sedimentiert, in 10ml des Puffers P1 resuspendiert, nach Zugabe von weiteren 10ml des Puffers P2 vorsichtig durch Invertieren des Gef¨aßes lysiert und schließlich durch Addition von 10ml des Puffers P3 pr¨azipitiert. Das Lysat wurde in die mitgelieferten QIAfiltereins¨atze gegeben und f¨ur 10min bei RT inkubiert.
In dieser Zeit konnte die bereitgestellte QIAGEN-tip 500 S¨aule durch Zugabe von 10ml des Puffers QBT equilibriert werden. Anschließend wurde das Bakterienlysat durch den QIAfil-ter von allen festen Bestandteilen befreit, die resultierende L¨osung auf die S¨aule geladen und die Matrix zweimal mit 30ml des Puffers QC gewaschen. Die Elution der DNS erfolgte mit 15ml des Puffers QF. Durch Zugabe von 10,5ml (0,7 Volumenanteile) Isopropanol wurde die eluierte DNS pr¨azipitiert, durch Zentrifugation f¨ur eine Zeit von 30min bei 15000 ∗ g und 4◦C sedimentiert und dann mit 5ml 70%igen Ethanol gewaschen, ohne das DNS-Pellet zu
3.2 Molekularbiologische Methoden
zerst¨oren. Nachdem dieses f¨ur 5 bis 10min an der Luft getrocknet worden ist, erfolgte die Aufnahme der DNS in 100µl - 200µl dH2O.
3.2.9 DNS-Isolation aus Agarosegelen (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen)
L¨osungen
Puffer QG gelb, pH</=7,5 Isopropanol
Puffer PE
Durchf¨uhrung DNS-Fragmente aus Restriktionsans¨atzen oder PCR-Reaktionen wurden mit einem sterilen Skalpell aus dem Agarosegel ausgeschnitten und mittels des QIAquick Gel Ex-traction Kits gem¨aß des Protokolls aus dem Gel eluiert. Im Detail wurden drei Volumina des Puffers QG zu einem Volumen DNS-Gelst¨uck gegeben (100mg entsprechen 100µl), die Mischung bei einer Temperatur von 50◦C unter Sch¨utteln inkubiert bis sich die Agarose kom-plett gel¨ost hat (ca. 10min) und dann ein Gelvolumen Isopropanol addiert. Nach Mischen der L¨osung durch Invertierung des Gef¨aßes wurde diese auf die S¨aule geladen und der Durch-lauf nach einem Zentrifugationsschritt von 1min 12000 ∗ g und RT verworfen. Dann wurde die Matrix der S¨aule mit 500µl des Puffers QG und 750µl des Puffers PE gewaschen und anschließend durch Zentrifugation getrocknet. Die Elution erfolgte mit 10µl-50µl dH2O.
3.2.10 DNS-Reinheitsanalyse und -Konzentrationsbestimmung
Die Reinheit und Konzentration von DNS wurde mit Hilfe eines Spektrophotometers (Ul-trospec 3000, Amersham Pharmacia Biotech) bestimmt. DNS-Pr¨aparationen mit einer Ratio A260/A280 zwischen 1,8 und 2,0 wurden f¨ur ausreichend rein befunden und f¨ur weitere Ver-suche eingesetzt.
3.2.11 DNS-Sequenzierung
(Step-by-Step protocols for DNA-sequencing with Sequenase-Version 2.0, 5th ed., USB, 1990) Die Sequenzierung von DNS erfolgte in der Sequenzierabteilung des Zentrums f¨ur Molekulare Neurobiologie Hamburg (ZMNH). Hierzu wurde 1µg DNS (1µl) in 6µl dH2O gel¨ost und mit 1µl des entsprechenden Sequenzierprimers (10pM) versetzt.