Molekularbiologische Arbeiten

2.2.1 Herstellung und Transformation von chemisch-kompetenten E. coli-Zellen

Die Fähigkeit einer Zelle Fremd-DNA aufzunehmen wird als Kompetenz bezeichnet. Hierbei werden Plasmide in kompetente Zellen eingeschleust. Für die Transformation in den Expressionsstamm E.

coli BL21 (DE3) und in den E. coli-Stamm TOP10, welcher zur Vervielfältigung von Plasmiden diente, wurden CaCl2-kompetente Zellen verwendet. Die Präparation erfolgt unter sterilen Bedingungen und verläuft nach COHAN¹⁴⁸.

Für die Transformation wurde ein Aliquot von 150 µl kompetenten Zellen auf Eis aufgetaut und mit 1-10 ng Plasmid-DNA bzw. 30 µl Ligationsansatz (siehe 2.2.8) versetzt. Der Ansatz wurde für 30-60 min auf Eis inkubiert bevor ein kurzer Hitzepuls von 45s bei 42°C erfolgte. Anschließend wurden die Zellen sofort wieder auf Eis gepackt und mit 750 µl dYT-Medium versetzt. Die Zellen wurden für weitere 30 min bei 37°C geschüttelt, dann bei 2300xg für 3 min pelletiert. Vom Überstand wurden 700 µl verworfen und mit dem verbleibenden Medium das Zellpelett resuspendiert und auf dYT-Agarplatten mit 50 µg/ml Kanamycin bzw. 300 µg/ml Ampicillin ausplattiert. Die Platten wurden über Nacht im Brutschrank bei 37°C inkubiert.

2.2.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Amplifikation von DNA-Fragmenten

Die Polymerase-Kettenreaktion diente zur Amplifikation von DNA-Fragmenten aus Plasmid-DNA. Die Grenze des zu amplifizierenden Bereiches bilden zwei Oligonukleotide, welche komplementär zu den 5‘-Enden dieses Bereiches sind. Für die Amplifizierung kurzer DNA-Fragmente wurden Taq- oder Phusion-DNA-Polymerase verwendet. Die Reaktionsbedingungen und PCR-Ansätze variierten in Abhängigkeit des verwendeten DNA-template, den Primern oder den Polymerasen. Nach einem initialen Denaturierungsschritt erfolgten 30 Zyklen von Denaturierung, Anlagerung der Primer und Elongation. Die Primer-Sequenz bestimmt hierbei hauptsächlich die Anlagerungstemperatur. Die Länge des zu amplifizierenden DNA-Fragments bestimmt die Elongationszeit. Hierfür wurde eine durchschnittliche Synthesegeschwindigkeit von 1 kbp/min angenommen. Im Wesentlichen bestand das PCR-Programm aus folgenden Parametern:

initiale Denaturierung: 94°C, 2 min Denaturierung: 94°C, 30 s Anlagerung der Primer: 58-68°C, 30-45 s Elongation: 72°C, 45-120 s

Anschließend erfolgte noch eine Auffüllreaktion für 10 min bei 72°C und abschließend die Lagerung bei 4°C. Das erhaltene PCR-Fragment wurde mit Agarose-Gelelektrophorese untersucht.

2.2.3 Kolonie-PCR

Zur Überprüfung eines bakteriellen Klons auf erfolgreiche Klonierung wurde eine Kolonie-PCR mit Taq-Polymerase und dem T7-Promotor/Terminator-Primerpaar durchgeführt. Die Ansatzgröße pro Klon betrug 10 µl, wobei die Konzentration der jeweiligen PCR-Reagenzien nicht verändert wurden.

Pro Ansatz wurde statt template-DNA eine Bakterienkolonie von der Agarplatte in den PCR-Ansatz gegeben und mit der gleichen Pipettenspitze ein Reaktionsgefäß mit 100 µl dYT-Medium angeimpft und bei 37°C geschüttelt. Anschließend wurde eine PCR durchgeführt wie unter 2.2.2 beschrieben.

Nach dem PCR-Programm wurde die Länge des PCR-Produkts mit Agarose-Gelelektrophorese überprüft und bei positivem Ergebnis die entsprechende Bakterienkultur in 5 ml dYT-Medium gegeben, über Nacht kultiviert und eine Plasmidpräparation nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Zur vollständigen Überprüfung wurden die Plasmide zur Sequenzierung gegeben.

2.2.4 Sequenzspezifische Mutagenese (QuikChange®)

Das QuikChange®-Verfahren wurde für den Austausch einzelner Aminosäuren verwendet oder das Einführen von Deletionen. Für den Austausch von einzelnen Aminosäuren wurden zwei komplementäre Primer verwendet, welche die Punktmutationen enthielten. Die Primer für Aminosäuredeletionen flankierten den zu deletierenden Bereich. Die Amplifikation der DNA erfolgte unter Verwendung der Pfu-Polymerase, welche eine hohe Prozessivität und eine proof-reading Funktion enthält. Das Ursprungsplasmid wurde mit Hilfe der DpnI-Endonuclease (Zielsequenz: 5‘-G^m6ATC-3‘) verdaut, welches als template-DNA nur methylierte und hemimethylierte DNA verwendet. Somit kann eine genaue Trennung von Mutterplasmid und dem mutagenisierten Plasmid erfolgen.

Ein 50 µl- Reaktionsansatz setzte sich wie folgt zusammen: 38 µl Nuclease-freies Wasser, 5 µl 10x Pfu-Puffer, 1,5 µl dNTPs (je 10 mM), je 2 µl Primer (10 µM), 0,5 µl template-DNA, 1 µl Pfu-Puffer (5 U/µl). In Abhängigkeit eines Aminosäureaustausches oder einer –deletion wurden 12 bzw. 18 Reaktionszyklen durchgeführt. Das verwendete PCR-Programm setzte sich wie folgt zusammen:

initiale Denaturierung: 94°C, 2 min Denaturierung: 94°C, 30 s Anlagerung der Primer: 58-68°C, 30-45 s

Elongation: 72°C, 7 min

Auch hier erfolgte eine Auffüllreaktion für 10 min bei 72°C. Der anschließende DpnI-Verdau erfolgte durch Zugabe von 1 µl FastDigest DpnI. Der Ansatz wurde für 30 min bei 37°C inkubiert. Anschließend erfolgte eine PCR-Reinigung mit Hilfe des JenaBioscience Kits und eine Ligation (siehe 2.2.8), bevor das erhaltene DNA-Fragment in E. coli Top10 transformiert wurde. Die erhaltenen Klone wurden mit einer Kolonie-PCR untersucht und bei positivem Ergebnis in eine 5 ml-dYT-Kultur überführt, hieraus das Plasmid isoliert und zur Sequenzierung gegeben.

2.2.5 Agarose-Gelelektrophorese

Die horizontale Agarose-Gelelektrophorese wurde zur analytischen Trennung von DNA-Fragmenten eingesetzt. In Abhängigkeit von der Länge des aufzutrennenden DNA-Fragments wurden Agarosekonzentrationen von 0,8% (w/v) bzw. 1,6% (w/v) in 1xTAE verwendet. Die Proben wurden mit 6x Ladepuffer versehen und auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte in TAE-Puffer bei einer konstanten Stromstärke von 65 mA. Die DNA-Banden wurden anschließend für 30 min in frischer Ethidiumbromidlösung (2 µg/ml in 1xTAE) gefärbt und unter UV-Licht mit 302 nm analysiert.

2.2.6 Plasmid-Isolierung aus E. coli

Die Isolierung von Plasmiden aus E. coli erfolgte aus einer 5 ml-Übernachtkultur mit Hilfe des Plasmid-Mini Prep-Kits. Hierfür wurden 3-4 ml der Übernachtkultur pelletiert und nach den Angaben des Herstellers über SpinColumns in einer Mikrozentrifuge gereinigt und mit 30 µl Elutionspuffer oder Nuclease-freiem Wasser eluiert. Die Lagerung der isolierten Plasmid-DNA erfolgte bei -20°C.

2.2.7 Restriktionsverdau und Dephosporylierung von DNA

Das Insertionsfragment wurde mit Hilfe von zwei Primern amplifiziert, wobei der N-terminale Primer eine NdeI-Schnittstelle und der C-terminale Primer eine BamH1-Schnittstelle enthielt. Das Plasmid und das Insertionsfragment wurden in einem 60 µl-Ansatz mit 2-5 µg DNA in 2xPuffer Tango und jeweils 10 U NdeI und BamH1 bei 37°C für 2-6 Stunden verdaut. Um die Religation des geschnittenen Vektors zu minimieren wurden die 5‘-Enden dephosphoryliert. Hierfür wurde in den Ansatz 10 U alkalische Phosphatase gegeben und bei 37°C für eine Stunde inkubiert.

2.2.8 Ligation von DNA-Fragmenten

Die geschnittenen und gereinigten DNA-Fragmente wurden in einem 30 µl-Ansatz mit einer Gesamtmenge von 500 ng eingesetzt. Das molare Verhältnis von Insertionsfragment und Vektor betrug hierbei 1:1 bis 5:1. Weiterhin enthielt ein Ansatz 3 µl 10-fach Ligase-Puffer und 10 U T4-DNA-Ligase. Der Ansatz wurde für 1-2 Stunden bei 22°C inkubiert, alternativ bei 16°C über Nacht.

Anschließend wurde die Ligase bei 65°C für 10 min inaktiviert und der Gesamtansatz in TOP10 Zellen transformiert.