5. Material und Methoden
5.4. Molekularbiologische Arbeiten
5.4.1. Isolierung und Qualitätskontrolle von RNA, cDNA Synthese
Das Probenmaterial wurde unter Stickstoffkühlung mit der Kugelmühle gemörsert. Die Isolation der RNA erfolgte anschließend mit dem RNAmini plant Kit (Qiagen, Germany) nach Angaben des Herstellers. Der Verdau von DNA wurde auf der Säule für 30 min durchgeführt (RNAse-free DNAse Set, Qiagen). Die spektroskopische Vermessung der Proben (Nanodrop) erfolgte zur Bestimmung der Konzentration, sowie zur Kontrolle über eine mögliche Kontamination mit Zuckern (OD230), Proteinen (OD280) und DNA (OD260≤1,8). Die Qualität der RNA wurde zusätzlich durch Kapillarelektrophorese mit Hilfe des QIAxcel advanced system (Qiagen) überprüft, wobei anhand des Elektropherogramms eine mögliche Degradation ausgeschlossen werden konnte.
Für die cDNA Synthese wurde 1 µg RNA (ad 10 µl dH2O) mit 1 µl OligodT-Primer (100 pmol/µl) für 5 min bei 70 °C inkubiert und anschließend in Eiswasser abgeschreckt. Anschließend wurden 9 µl eines Mastermixes aus 4 µl dNTP (10 mM), 4 µl 5x Reaktionspuffer (Promega, Germany), 100 U Reverse Transkriptase M-MLV-RT(H-) (Promega) und H2O (ad 9 µl) zu gegeben. Die Reaktion der Reversen Transkriptase erfolgte nach dem Thermalprofil von 40 °C (10 min), 42 °C (50 min) und 70 °C (15 min). Nach Beenden der Reaktion wurden die Proben auf Eis abgeschreckt. Die weitere Lagerung erfolgte bei -20 °C.
5.4.2. Quantitative RT-PCR
Auf Basis von in cDNA-umgeschriebener RNA können mit quantitativer RT-PCR Expressionsstudien spezifischer Gene durchgeführt werden. Hierbei handelt es sich um eine relative Methode, bei der die Häufigkeit der Transkripte des Zielgens in Relation zu einem Referenzgen betrachtet wird. Der Fortschritt der Amplifikation der PCR-Produkte wird in Echtzeit nach jedem Zyklus erfasst, indem die Fluoreszenz eines Farbstoffes detektiert wird, der nach Interkalierung in dsDNA fluoresziert und somit die Menge an PCR-Produkt anzeigt. Als Fluorszenzfarbstoff wurde EvaGreen verwendet, der in einem ready-to-use Mastermix vorlag. Eine Reaktion enthielt 2 µl 5x EvaGreen QPCR Mix II (bio&Sell), je 1 µl Primer (2 pmol/µl), 3 µl cDNA (1:20) und H2O (ad 10 µl). Jede Reaktion wurde in Triplikaten analysiert. Primer wurden einheitlich für eine Annealing-Temperatur von 60 °C und einer Produktlänge von 50 bp designt und sind in Tabelle 2 aufgelistet. Die Reaktion erfolgte nach folgendem Thermalprofil: 95 °C (15 min), 95 °C (15 s), 60 °C (30 s), wobei die Schritte 2 und 3 in 40 Zyklen wiederholt wurden. Die Schmelzkurve zur Kontrolle der PCR-Produkte wurde mit folgenden Thermalprofil entwickelt: 95 °C (10 s), 60-95 °C in 0,5
°C*s-1-Schritten. Es wurde das qRT-PCR-System CFX Connect (bio-rad, Germany), sowie die zugehörige Software CFX Manager zur primären Datenauswertung verwendet. Die Auswertung wurde anhand der relativen cq-Methode unter Verwendung des Referenzgens TIP41, ein Typ 2A Phosphatase Aktivatorprotein (SGN-U584254), (Exposito-Rodriguez et al., 2008) durchgeführt. Unter Annahme einer Verdoppelungsrate wurde die Transkriptmenge des Zielgens (ZG) relativ zum Referenzgen (RG) nach folgender Formel berechnet:
= 2 ( ( ! (" !!
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Tabelle 2: Primersequenzen
Genname (SGN-Nummer) Sequenz [5'->3'] Tm [°C] PCR-Produkt [bp]
Referenzgen
TIP41 for_ TCA GTG GGA GGA TTG TAA GG 57,3 56
(SGN-U584254) rev_ GGT TCT TTA GAC GCC AAT GC 57,3
JA-assoziierte Gene
AOC for_ TTC TAC TTC GGC GAT TAC GGT C 60 50
(SGN-U562649) rev_ GGT TAA GTA CGC TCC CTG AAC G 60
JAZ1 for_ CTG ATC AAT CTG GTG TGA GTT TTG 59,3 50
(SGN-U579837) rev_ CAG AAG GCT GTG GCA TTG AC 59,4
JAZ3 for_ CCC GAG TCT AAT GGA GTT GG 59,4 56
(SGN-U564449) rev_ CTT ACC GGC TAA CAG AGG AG 59,4
JAZ8 for_ CAA GTA GAG GAA TGG AGA TG 55,3 53
(SGN-U576446) rev_ ATG GTG ATG AAG GCT CAG AC 57,3
PIN2 for_ AAT CTT GGG TTC GGG ATA TGC 60 50
(SGN-U578366) rev_ GGG ATT TAG CGG ACT TCC TTC T 60
Cathepsin D inhibitor for_ CCG TGG TGA TGA CTT CTG TG 59,4 70
(SGN-U577283) rev_ GAC AAG AGC CAA ACG CCT TC 59,4
LAP for_ CCT GGT AAT GGC GGT GCT ATA A 60 50
(SGN-U577971) rev_ TCG AGA TGC AAC CAC TGA ACC 60
TD for_ CTT TAT GCC GTT ACC GTA ATC AGG 60 50
(SGN-U570558) rev_ GGA ACT TGG AAT CCC ATC AAC A 60
MYB-Transkriptionsfaktoren
MYB-TF for_ TGC TGG TCT CAA ACG TAC TG 57,3 45
(SGN-U576253) rev_ TAG CCA TCG GAG TCT ACA AC 57,3
MYB-TF for_ TCC TAA TTG GCG TGC ACT TC 57,3 48
(SGN-U564591) rev_ TCC GCA CCT TAA TAG ACC TG 57,3
ET/Seneszenz-assoziierte Gene im Staubblatt
rinMADS-Box TF for_ CAA ACA TCA TGG CAT TGT GG 55,3 60
(SGN-U578471) rev_ ATG AGA AGG CTG TTC ATG TC 55,3
fruitfull TF for_ GAA CCT TGC AGC TCA AAC TC 57,3 56
(SGN-U578128) rev_ GGC AAA GGG TAA TTC CGA TG 57,3
ACS8 for_ GGG CGA TTT ACT CAA ACG AC 57,3 45
(SGN-U565888) rev_ TTG TAG CCG CGG AGA CAA TG 59,4
ACO for_ TCA GTG GTC TCC AAC TAC TC 57,3 54
(SGN-U577773) rev_ GCA TCG GTG GAA CAT CAA TC 57,3
AP2/ERF for_ CTT CTT TCA GCC ACA AAC TC 55,3 52
(SGN-U577093) rev_ GCT GTT GCT ACT GCT ATT GC 57,3
ETR6 for_ GCT GCA GTG GTT GAA GAA TC 57,3 53
(SGN-U581694) rev_ TTC TGT TCC GTC AAC CTG TC 57,3
AOX1b for_ CGG GAC CTA AAT CAC TTT GC 57,3 50
(SGN-U589545) rev_ AAC TCA TGC CCT TGA CAC TG 57,3
Pirin-like for_ CCT GGA ATG CCT TCC TCT AC 59,4 50
(SGN-U574326) rev_ AGA ACC AAA CGC TCC CTC TC 59,4
Dehydrin for_ ACG CCA GCA TGG TAC TCT TG 59,4 55
(SGN-U290489) rev_ GGA GCT AGA GCT GCC AGA AC 61,4
Endoglucanase 1 for_ GGA TGG CCC ATG GCT TAT TC 59,4 48
(SGN-U570620) rev_ CAA TAG CAG CCC AAC TCA AC 57,3
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Tabelle 2: Primersequenzen (Fortsetzung)
Genname (SGN-Nummer) Sequenz [5'->3'] Tm [°C] PCR-Produkt [bp]
GA-assoziierte Gene in den Samenanlagen
GA 20 oxidase 1 for_ TAC ACT GCC GCA AAG CAA CC 59,4 48
(SGN-U572959) rev_ AGA AAT CCG ATG CGC GTT GG 59,4
GA-regulated protein for_ GAG TGT CAT TGC CTT CCT TC 57,3 59
(SGN-U569971) rev_ CTA TAG CAA GGG CAC TCA TC 57,3
PCD-assoziierte Gene in den Samenanlagen
Metacaspase for_ AGC CAC TTA AAC AAG ATG AG 53,2 54
(SGN-U585105) rev_ TCT TCA TTA GCT TGA CAT CC 53,2
Endonuklease for_ GGG CTT GTT GAA TGA TGA GG 57,3 48
(SGN-U569204) rev_ CGG CAA CAA CAT CTT GAC TG 57,3
Subtilase for_ GGC GCA CAT CCT GAA TGG AG 61,4 45
(SGN-U578578) rev_ CAT GGC GGA GCG AAT AGC TG 61,4
Subtilase for_ AGG AAC ATC CAT GGC TTG TC 57,3 60
(SGN-U565053) rev_ TGT GCG CCT TTA AGA AGT GC 57,3
Subtilase for_ AGC CAC AAC TGC TCA AAT CC 57,3 55
(SGN-U577337) rev_ AGG CAA TGA ATG ACG GGT AG 57,3
ACO-like protein for_ GTG GAC TCC AAG TTC TTC AC 57,3 54
(SGN-U579001) rev_ CCA CGT ATA GGA GGA ACA TC 57,3
β-Glucosidase for_ CAG AGC TGC TGC AAG TAG AG 59,4 51
(SGN-U583073) rev_ ATC AAG GAA CCA GCC AAG TC 57,3
Endo-1,4-β-Mannosidase for_ TGT TGC TGC TGA GCC TAG TG 59,4 42
(SGN-U586045) rev_ GAC CTC GGA GAC CTT GTA CC 61,4
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5.4.3. Transkriptomanalysen: MicroArray-Datenauswertung
Die Durchführung der Arrays, sowie die Probenpräparation ausgehend von der RNA wurden von einer externen Firma (AtlasBiolabs, Berlin) durchgeführt. Dafür wurde 1 µg RNA pro Probe (10 µl einer Konzentration von 100 ng/µl) versendet.
Die MicroArrays wurden unter Verwendung von Agilent-Tomato 44K-full genome chips durchgeführt. Die von Agilent mitgelieferte Nomenklatur ist somit Basis der anfänglichen Auswertung. Die erste Bearbeitung der Rohdaten fand mit ArrayStar (www.dnastar.com) statt. Dazu wurden zunächst alle Proben über das für Microarrays gängige quantil-Verfahren normalisiert. Es folgte eine p-Wert-Korrektur nach Benjamini-Hochberg. Spots, die nach angegebener Nomenklatur zu einem Gen zugehörig waren, wurden zusammengefasst betrachtet.
Die Datensets für Samenanlagen- bzw. Staubblattproben wurden in der Rohdatenauswertung einzeln betrachtet, sodass die Normalisierung nur innerhalb des jeweiligen Datensets stattfand. Um differenziell exprimierte Gene in bestimmten Stadien zu bestimmen, wurden die Daten für WT und jai1 im Scatterplot gegeneinander für das jeweilige Stadium aufgetragen. Somit ergaben sich für die 2 Organe und die 3 Entwicklungsstadien 6 Scatterplots. Als differenziell exprimiert wurden jene Gene definiert, die zwischen WT und jai1 mindestens einen foldchange von 8 und einen bestimmten Grad der statistischen Sicherheit durch die durchgeführte p-Wert-Korrektur nach Benjamini-Hochberg aufwiesen. Im Falle der Staubblattproben konnte mit einer statistischen Sicherheit von 99 % und im Falle der Samenanlagenproben mit 95 % gearbeitet werden. Grund für den niedrigeren Wert bei den Samenanlagenproben war das Abweichen einer Probe innerhalb der drei biologischen Replikate, welche bereits in der PCA-Analyse auffiel (Teil der statistischen Auswertung durch AtlasBiolabs). Es folgte eine Erstellung von Venn-Diagrammen für die 2 Organe. Durch Vergleich der Gene, die im Stadium 1, 3 oder 6 gefunden wurden, konnte ermittelt werden, welche Gene spezifisch nur in einem Stadium, in zwei Stadien oder über die gesamte Entwicklung differenziell exprimiert waren. Diese stadiums-spezifischen Gensets konnten dann in Folge weiter bearbeitet werden.
Ein Abgleich der von Agilent verwendeten Nomenklatur zeigte auf, dass nur ein geringer Prozentsatz der Spotsequenzen annotierten Genen zugeordnet war. Die Annotation basierte auf UnigeneID (ncbi) und betrachtet z.T. cDNA und EST eines Genes einzeln. Eine aktuellere Nomenklatur stellte hierbei die von Solgenomics verwendete SGN-Nomenklatur dar (www.solgenomic.net). Ausgehend von einer Zuordnung der Agilent-Chip-Sequenzen, die auf die SGN-Sequenzen gemapped wurden (bezogen von:
www.mapman.gabipd.org), folgte eine neue Nomenklatur-Zuordnung der Gene/Chip-Spots. Anhand dieser konnten Spots zusammengefasst werden, denen gleiche SGN-Sequenzen zugeordnet wurden. Die Zuordnung wurde zusätzlich überprüft durch Verwendung von Nucleotide blast (www.ncbi.nlm.nih.gov/) und gegebenenfalls korrigiert. Wenn Spotsequenzen und SGN-Sequenzen als zusammengehörig definiert werden konnten, erfolgten die Berechnung von Mittelwerten und Standardabweichung, sowie die grafische Darstellung des Genexpressionsverlaufs über die Entwicklung, anhand der Rohdaten mit Excel (www.office.microsoft.com/de-de/excel/). Für Gruppenanalysen wurden die Mittelwerte der Rohdaten MAX-normalisiert, so dass die Werte jeweils im prozentualen Bezug zu dem größten gemessenen Wert der WT und jai1-Wertereihe dargestellt sind. Die Aufteilung der Gruppen erfolgte nach Stadium, welches durch die Venn-Diagramme bestimmt wurde, nach Genexpressionsverlauf über die Entwicklung und der Art der Regulation (hoch/runter) im jeweiligen Stadium. Hochregulierte Gene wurden nach Verlauf in der jai1 in Gruppen eingeordnet, während runterregulierte Gene nach dem Verlauf im WT zugeordnet wurden. Eine Validierung der Expression ausgewählter Gene erfolgte mittels qRT-PCR eines weiteren unabhängigen Pflanzenansatzes.
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