SOB-Medium
2.8 Modifikationen von DNA
2.8.1 Restriktionsspaltung
Referenzen:
Nathans et al., 1975 Feinberg & Vogelstein, 1983
Hanahan, 1989 Sambrook et al., 1989 Kessler & Manta, 1990
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Restriktionsspaltungen erfolgten unter Verwen-dung von Restriktionsenzymen der Firma MBI Fermentas.
Restriktionsenzyme werden aus Bakterien isoliert, die diese zum Schutz vor Viren durch De-gradierung (Hydrolyse) der viralen DNA einsetzen. Die Bezeichnung der Nucleasen leitet sich von dem Organismus ab, aus dem sie (ursprünglich) isoliert wurden (z. B. Pst I aus Pro-videncia stuartii). Im Labor kommen meist Restriktionsenzyme vom Typ-II zum Einsatz. Ein solches Typ-II-System findet man in etwa einem von drei Bakterienstämmen. Die Erkennungsstellen für Typ-II-Enzyme sind häufig Palindrome von vier bis sechs, seltener von acht Basenpaaren. Die Spaltungsstelle ist identisch mit oder nahe bei der Erkennungsstelle.
Die Sequenzen sind, sofern sie im Genom des Bakteriums selbst vorkommen, durch Methylierung an einem Adenin- oder Cytosinrest vor der hydrolytischen Spaltung geschützt.
Fremde DNA ist an diesen Stellen für gewöhnlich nicht methyliert und wird von den Nucleasen gespalten. Bei Restriktionsenzymen wird eine Enzymeinheit (1 u) als die Aktivität der Enzymmenge definiert, welche benötigt wird, 1 µg einer DNA-Kontrollsequenz in einem Ansatz mit einem Volumen von 50 µl bei optimaler Temperatur innerhalb von einer Stunde vollständig zu spalten. Auf welche DNA-Kontrollsequenz sich die Angabe im Einzelnen bezieht, ist den jeweiligen Herstellerangaben zu entnehmen. In den meisten Fällen handelt es sich dabei um λ-DNA.
Die für den Restriktionsansatz benötigte Enzymmenge (Anzahl der Units) richtet sich sowohl nach der Länge des zu spaltenden Fragmentes als auch nach der Anzahl der in diesem Fragment vorliegenden Schnittstellen und wird mit folgender Gleichung ermittelt:
Sequenz DNA
spaltender zu
in llen Schnittste der
Anzahl
quenz Kontrollse DNA
der in llen Schnittste der
Anzahl quenz
Kontrollse DNA
der Länge
Sequenz DNA
spaltenden zu
der Länge
U =
− −×
** − −* Anzahl der Schnittstellen des verwendeten Restriktionsenzymes, nicht die Gesamtzahl aller Schnitt-stellen!
Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Spaltungen wurde im allgemeinen die dop-pelte der theoretisch benötigten Enzymmenge eingesetzt. Dabei ist bei einigen Restriktionsenzymen zwingend darauf zu achten, dass die finale Menge an Glycerin (Aufbewahrung der Enzyme erfolgt in Glycerin) im Restriktionsansatz bestimmte Konzentrationen nicht überschreitet, da diese Enzyme andernfalls ihre Aktivität einbüßen.
Diese Informationen sind den Herstellerangaben im Vorfeld zu entnehmen. Abhängig von der Art der Aufreinigung der zu spaltenden DNA ist dem Restriktionsansatz RNAse A in einer Finalkonzentration von 0,2 µg/µl zuzugeben. Sofern der verwendete 10x Reaktionspuffer kein Rinderserumalbumin (BSA) enthält, ist dieses zum Schutz des Restriktionsenzymes vor einem proteolytischen Abbau durch vorhandene Proteasen separat hinzuzugeben.
Die Inkubationszeit des Restriktionsansatzes variiert in Abhängigkeit von der verwendeten Nuclease zwischen wenigen Minuten und mehreren Stunden. Die einzustellende Inkubati-onstemperatur hängt ebenfalls von der verwendeten Nuclease ab und ist den Herstelleran-gaben zu entnehmen. Für die spätere Herstellung chimärer DNA ist die Erzeugung kohäsiver Enden der von glatten Enden unbedingt zu bevorzugen. Ein mit Hilfe von zwei verschiede-nen Restriktionsenzymen (von deverschiede-nen zumindest eines kohäsive Enden erzeugt) generiertes Fragment lässt sich gerichtet in einen entsprechend geschnittenen Vektor ligieren. Bei glat-ten Enden sind stets zwei Orientierungen des Fragmentes im Vektor möglich.
2.8.2 Glätten kohäsiver Enden von DNA-Fragmenten
Referenzen:
Clark, 1988 Sambrook et al., 1989 Ausubel et al., 2001
Einige Restriktionsenzyme wie z. B. Hpa I erzeugen glatte Enden. DNA-Fragmente mit glat-ten Enden (auch wenn diese von unterschiedlichen Restriktionsenzymen generiert worden sind) lassen sich ohne weiteres miteinander ligieren. Viele Restriktionsenzyme erzeugen jedoch versetze Schnitte, wodurch an den Enden Überhänge einzelsträngiger DNA entste-hen. Derartige Enden werden als kohäsive Enden bezeichnet. Solange kohäsive Enden zweier DNA-Fragmente mit dem gleichen Restriktionsenzym oder mit Nucleasen, die identi-sche Enden hervorbringen, erzeugt worden sind, ist deren Ligation absolut problemlos. Un-terscheiden sich die kohäsiven Enden jedoch voneinander, ist eine Ligation nicht ohne weite-re Modifikation der Überhänge möglich. Um auch derartige Fragmente miteinander ligieweite-ren zu können, müssen zunächst die überstehenden Enden geglättet werden. Das heißt, die kohäsiven Enden werden in glatte Enden umgewandelt. Für derartige Reaktionen wurde die T4 DNA-Polymerase der Firma MBI Fermentas verwendet. Dabei handelt es sich um eine
eines Primers die 5´→3´ Synthese an einzelsträngiger DNA als Matrize katalysiert. Das En-zym verfügt über eine 3´→5´ Exonuclease Aktivität, jedoch nicht über eine 5´→3´ Exonuc-lease Aktivität. Ursprünglich stammt dieses Enzym aus dem Bakteriophagen T4. Es wird heute jedoch vorwiegend mit Hilfe gentechnisch manipulierter E. coli Bakterien gewonnen.
Folgendes Protokoll zum Glätten kohäsiver Enden mit Hilfe der T4 DNA-Polymerase wird von Seiten des Herstellers empfohlen:
1. Herstellen des Reaktionsansatzes:
gespaltene DNA 1 µg
5x Reaktionspuffer (s. u.) 4 µl
2 mM dNTP Mix 1 µl
T4 DNA-Polymerase 1 u
Wasser (nucleasefrei) ad 20 µl
2. Inkubation des Reaktionsansatzes für 20 min bei 11 °C oder alternativ für 5 min bei Raumtemperatur.
3. Abbruch der Reaktion durch Erhitzen des Ansatzes auf 70 °C für 10 min.
Zur weiteren Nutzung für die anschließende Ligationsreaktion wird der Ansatz durch Zugabe von 20 µl eines Phenol/Chloroform-Gemisches (1:1) und anschließender Zentrifugation in einer Tischzentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit extrahiert. Der Überstand wird ent-nommen und die in ihm enthaltene DNA durch Zugabe des 2,5fachen Volumens Ethanol abs. und eines zehntel Volumens 3 M NaAc (pH 4,8) während der anschließenden Zentrifu-gation (5 min, 20000 x g, 4 °C) gefällt. Der Überstand wird abgenommen und verworfen. Der verbleibende Niederschlag (DNA) wird in 70%igem Ethanol gewaschen. Dieser wird nach erneuter Zentrifugation vollständig entfernt. Der Niederschlag wird in der gewünschten Men-ge A. bidest aufMen-genommen und kann nun zur Ligation verwendet werden.
5x Reaktionspuffer: 335 mM Tris-HCl (pH 8,8 bei 25 °C), 33 mM MgCl2, 5 mM DTT, 84 mM (NH4)2SO4.
2.8.3 Dephosphorylierung der 5´-Enden linearer DNA-Fragmente
Referenzen:
Sambrook et al., 1989
Mit einem einzelnen Restriktionsenzym oder mit komplementäre Enden erzeugenden Nuc-leasen linearisierte Klonierungsvektoren neigen stark zur Wiederverknüpfung, ohne dass ein Fragment eingefügt wird. Um derartige Wiederverknüpfungen zu vermeiden und somit die Effizienz der DNA Insert Ligation (s. 2.8.4) zu erhöhen, müssen in einem solchen Falle die 5´-Enden der linearisierten Vektoren zunächst dephosphoryliert werden. Für derartige Modi-fikationen wurde eine Shrimps Alkaline Phosphatase (SAP) der Firma MBI Fermentas ver-wendet.
Für die Dephosphorylierung freier 5´-Enden mit der Shrimps Alkalinen Phosphatase wird seitens des Herstellers folgendes Protokoll empfohlen:
1. Lösen von 1-10 pmol freier DNA-Enden in 10-40 µl nucleasefreiem Wasser 2. Herstellen des Reaktionsansatzes:
gelöste DNA 10-40 µl
10x Reaktionspuffer 5 µl
Wasser (nucleasefrei) ad 49 µl
Shrimp Alkaline Phosphatase (1 u) 1 µl
3. Inkubation des Reaktionsansatzes für 30 min bei 37 °C.
4. Abbruch der Reaktion durch Erhitzen des Ansatzes auf 65 °C für 15 min.
Zur weiteren Nutzung für die anschließende Ligationsreaktion wird der Ansatz durch Zugabe von 50 µl eines Phenol/Chloroform-Gemisches (1:1) und anschließender Zentrifugation in einer Tischzentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit extrahiert. Der Überstand wird ent-nommen und die in ihm enthaltene DNA durch Zugabe des 2,5fachen Volumens Ethanol abs. und eines zehntel Volumens 3 M NaAc (pH 4,8) während der anschließenden Zentrifu-gation (5 min, 20000 x g, 4 °C) gefällt. Der Überstand wird abgenommen und verworfen. Der verbleibende Niederschlag (DNA) wird in 70%igem Ethanol gewaschen. Dieser wird nach erneuter Zentrifugation vollständig entfernt. Der Niederschlag wird in der gewünschten Men-ge A. bidest aufMen-genommen und kann nun zur Ligation verwendet werden.
2.8.4 DNA Insert Ligation in Vektor-DNA
Referenzen:
Cohen et al., 1973 Cohen, 1975 Engler et al., 1982 Sambrook et al., 1989 Rossi et al., 1997 Ausubel et al., 2001
Zur Verknüpfung eines DNA-Fragmentes mit einem Klonierungsvektor ist eine Reaktion zwi-schen den Enden des Fragmentes einerseits und den Enden des Vektors andererseits erfor-derlich. Komplementäre Enden lagern sich durch Basenpaarung aneinander. Dem so ent-stehenden chimären Plasmid fehlen nun lediglich die kovalenten Phosphodiester-Bindungen zwischen den aneinander gelegten 5´-Phosphat und 3´-Hydroxyl Termini. Diese werden durch DNA-Ligasen hergestellt. DNA-Ligasen ermöglichen darüber hinaus auch die Verknüp-fung freier glatter Enden. Im für die Reaktion erforderlichen Ansatz sollte die Konzentration der freien Enden des Inserts mindestens dreimal so hoch sein wie die der freien Enden des Klonierungsvektors. Zur Konzentrationsbestimmung können die zu verknüpfenden Fragmen-te (jeweils nur eine Teilmenge) zunächst auf ein Agarose-Gel aufgetragen werden (s. 2.9.1).
Die Konzentrationen lassen sich dann anhand der Bandenstärken abschätzen. Handelt es sich bei den zu ligierenden Fragmenten um nicht aufgereinigtes Geleluat ist die Konzentrati-onsabschätzung anhand der Stärken der eluierten Banden vorzunehmen. Sämtliche Ligati-onsreaktionen wurden mit der T4 DNA-Ligase der Firma MBI Fermentas durchgeführt. Ur-sprünglich aus dem T4 Bakteriophagen isoliert wird das Enzym heute gentechnisch aus E. coli Zellen gewonnen, die das Gen 30 des Phagen tragen.
Für die DNA Insert Ligation mit Hilfe der T4 DNA-Ligase empfiehlt der Hersteller die Ver-wendung des folgenden Protokolls:
1. In einem Reaktionsgefäß werden 5-10 µl einer Mischung aus gespaltener Vektor-DNA (50-400 ng) und des zu ligierenden Inserts in (nucleasefreiem) Wasser oder TE-Puffer vorgelegt.
2. Dem Ansatz sind hinzu zu geben:
10x Ligationspuffer 2 µl
50%ige PEG 4000 Lösung (nur bei glatten Enden) 2 µl
T4 DNA-Ligase 1-2 u (kohäsive Enden)
5 u (glatte Enden)
Wasser (nucleasefrei) ad 20 µl
3. Durchmischen des Reaktionsansatzes durch intensives Schütteln. Anschließend kur-ze Zentrifugation (3-5 s) in einer Tischkur-zentrifuge.
4. Inkubation des Ligationsansatzes bei 22 °C für eine Stunde.
5. Inaktivierung der T4 DNA-Ligase durch Erhitzen des Ligationsansatzes auf 65 °C für 10 min.
6. Der Ansatz kann direkt zur Transformation in kompetente E. coli Zellen verwendet werden (s. 2.6.1.2).
Zur Steigerung des Ertrages an Ligationsprodukten kann die Inkubationszeit erhöht wer-den (über Nacht).
Die Zugabe von Polyethylenglycol (PEG) zum Reaktionsansatz erhöht die Ligationsrate freier glatter DNA-Enden. Die empfohlene Finalkonzentration an PEG 4000 im Ansatz liegt bei 5 % (w/v).
10x Ligationspuffer 400 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP (pH 7,8 bei 25 °C) TE Puffer 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7,8)