Die Mitochondrien - Untersuchung des Myo2-abhängigen Transports von Mitochondrien in Saccharomy

1. Einleitung

1.1 Die Mitochondrien

1. Einleitung

1.1 Die Mitochondrien

Bereits vor über 160 Jahren wurden Mitochondrien in Muskelzellen beobachtet (von Kölliker, 1857). Carl von Benda gab ihnen 1898 diesen Namen, der sich aus den griechischen Wörtern mitos (Faden) und chondrion (Körnchen) zusammensetzt. Vor mehr als 100 Jahren wurde zudem die Endosymbiontentheorie formuliert und in den 1960er Jahren des letzten Jahrhunderts wieder aufgegriffen (Margulis, 1970; Mereschkowsky, 1905; Sagan, 1967;

Schimper, 1883). Diese besagt, dass es sich bei Mitochondrien anfänglich um Bakterien handelte, die von einer anderen Zelle aufgenommen wurden. Die Sequenzanalyse 16S ribosomaler RNA der Mitochondrien erbrachte, dass sie von einem -Proteobakterium abstammen dürften (Yang et al., 1985). Ein Relikt dieses Vorgangs ist, dass Mitochondrien von zwei Membranen umgeben sind. Zwischen der mitochondrialen Außenmembran und der mitochondrialen Innenmembran liegt der sogenannte Intermembranraum. Die Innenmembran weist Invaginationen, die Cristae, auf (Frey und Mannella, 2000). In der Cristae-Membran befindet sich die ATP-Synthase sowie die Bestandteile der Elektronentransportkette. Dort findet die oxidative Phosphorylierung statt (Wurm und Jakobs, 2006). Die mitochondriale Innenmembran umgibt die mitochondriale Matrix. Mitochondrien enthalten ein eigenes Genom, die mitochondriale DNA (mtDNA), welche in der Matrix zu finden ist (Nass und Nass, 1963; Schatz et al., 1964). Die meisten der ursprünglichen mitochondrialen Gene sind im Laufe der Zeit in das Kerngenom transferiert worden. Einige Gene für Komponenten der Atmungskette und der mitochondrialen Translationsmaschinerie sind jedoch noch immer mitochondrial kodiert (Chen und Butow, 2005). Mitochondrien können nicht de novo entstehen, sondern bilden sich durch Teilung bereits bestehender Mitochondrien. Da in den Mitochondrien wichtige Prozesse wie die ATP-Synthese, die Synthese von Eisen-Schwefel-Clustern und der Lipidmetabolismus stattfinden, sind sie für das

2 Überleben der Zelle essentiell und dürfen während der Zellteilung nicht verloren gehen (Lill und Mühlenhoff, 2005; Scheffler, 2001).

Dabei sind Mitochondrien keine vom Rest der Zelle isolierten Organellen, sondern stehen in Kontakt zu zahlreichen anderen Zellbestandteilen. Der sogenannte ERMES-Komplex (ER mitochondria encounter structure) verknüpft beispielsweise in der Bäckerhefe das endoplasmatische Retikulum (ER) mit der mitochondrialen Außenmembran und besteht aus den Komponenten Mmm1, Mdm10, Mdm12, Mdm34 sowie Gem1 (Kornmann et al., 2009, 2011). Bisher ist noch nicht vollständig erforscht, welche Funktionen diese Kontaktstellen zwischen Mitochondrien und ER haben. Ein Vorgang, der an diesen Stellen beobachtet werden kann, ist der Austausch von Lipiden. Zudem sind diese Kontakte unter anderem wichtig für den Calcium-Austausch und die mitochondriale Teilung (Friedman et al., 2011; Kornmann und Walter, 2010; Mao und Klionsky, 2013; Rowland und Voeltz, 2012; Tatsuta et al., 2014). Auch Kontakte der Mitochondrien mit Vakuolen sind erkannt worden (Elbaz-Alon et al., 2014;

Hönscher et al., 2014). Die sogenannten vCLAMPs (vacuolar and mitochondrial patch) spielen vermutlich ebenfalls eine zum ERMES redundante Rolle im Lipidaustausch und könnten darüber hinaus für den Austausch von Aminosäuren wichtig sein (zusammengefasst in Murley und Nunnari, 2016). Zudem wurden Kontakte der Mitochondrien mit Peroxisomen beobachtet (Cohen et al., 2014). Diese befinden sich in unmittelbarer Nähe des ERMES-Komplexes. Eine mögliche Funktion dieser Kontakte könnte der Transport von Acetyl-CoA aus den Peroxisomen in die Mitochondrien sein. Dieses wird für den Citratzyklus in den Mitochondrien benötigt und wird sowohl in den Mitochondrien als auch in Peroxisomen gebildet. Die Kontakte könnten wichtig sein, um unter stationären Bedingungen Mitochondrien zusätzliches Acetyl-CoA zuzuführen, oder um die Acetyl-CoA Konzentration in bestimmten Kompartimenten der Mitochondrien hochzuhalten (Cohen et al., 2014).

3 1.2 Fusion und Teilung der Mitochondrien

Mitochondrien sind hoch dynamisch. Während in Lehrbüchern der Eindruck vermittelt wird, es handele sich um Organellen, die vereinzelt und isoliert in der Zelle vorliegen, so stellt sich die Realität weitaus komplexer dar. Die Mitochondrien bilden ein Netzwerk in der Zelle, das ständig Fusion und Teilung durchläuft. Diese Prozesse sind unter anderem wichtig für die Vererbung und die Aufrechterhaltung funktioneller Mitochondrien sowie für Apoptose (zusammengefasst in Hermann und Shaw, 1998 sowie Westermann, 2010). Die Fusion der Mitochondrien wird in Saccharomyces cerevisiae durch die Proteine Fzo1, Mgm1 und Ugo1 vermittelt. Die GTPase Fzo1 vermittelt dabei die Fusion der Außenmembran (Hermann et al., 1998). Ugo1, das wie Fzo1 in der mitochondrialen Außenmembran verankert ist, wirkt als Mediator zur Dynamin-verwandten GTPase Mgm1, welche für die Fusion der Innenmembran verantwortlich ist (Sesaki und Jensen, 2004; Wong et al., 2003). Mgm1 liegt in zwei Isoformen vor, die beide für die Fusion der Mitochondrien benötigt werden (Herlan et al., 2003). Eine Isoform lokalisiert im Intermembranraum zwischen Außen- und Innenmembran, die andere in der Innenmembran. Ist eines der drei Gene deletiert, so resultiert dies in der Fragmentierung der Mitochondrien, da die Mitochondrien einerseits nicht mehr fusionieren können, während sie gleichzeitig stetig Teilung durchlaufen (Wong et al., 2000).

Die Teilung der Mitochondrien wird in der Bäckerhefe durch die Dynamin-verwandte GTPase Dnm1, sowie Mdv1 und das mitochondriale Außenmembranprotein Fis1 vermittelt (Tieu und Nunnari, 2000; Tieu et al., 2002). Dabei rekrutiert Fis1 die Proteine Dnm1 und Mdv1 zu punktuellen Strukturen auf den Mitochondrien (Mozdy et al., 2000; Tieu und Nunnari, 2000).

Dnm1-Moleküle lagern sich spiralförmig zusammen, wirken bei der Teilung der Mitochondrien als kontraktiler Ring und schnüren diese ab (Ingerman et al., 2005). Diese Spiralen sind jedoch zu klein, um sich um die Mitochondrien legen zu können. Möglich wird dies jedoch, indem sich das ER um die Mitochondrien legt und diese einschnürt, bis sich der Dnm1-Ring um diese Einschnürungen legen kann (Friedman et al., 2011). In Δdnm1 Zellen liegt die mitochondriale Masse als verknüpftes Netzwerk vor (Bleazard et al., 1999). Fehlen sowohl Dnm1 als auch

4 Fzo1, so laufen in der Zelle weder Fusion noch Teilung ab. Die Mitochondrien liegen wildtypähnlich verzweigt vor, weisen jedoch keine Dynamik auf (Sesaki und Jensen, 1999). In Δfzo1 kann neben dem Fusionsdefekt der Verlust mitochondrialer DNA beobachtet werden (Hermann et al., 1998; Rapaport et al., 1998). Der Verlust der mtDNA wird verhindert, wenn neben FZO1 auch DNM1 deletiert ist (Bleazard et al., 1999).

1.3 Der mitochondriale Transport in Saccharomyces cerevisiae

Nicht nur ihre dynamische Natur ist wichtig, um in den Zellen stets funktionelle Mitochondrien vorliegen zu haben. Wie bereits erwähnt sind Mitochondrien essentielle Organellen. Daher muss während der Zellteilung sichergestellt sein, dass sowohl Mutter- als auch Tochterzelle Mitochondrien erhalten. Tatsächlich findet der Transport aktiv und kontrolliert statt. In vielen eukaryotischen Zellen werden Mitochondrien entlang der Mikrotubuli transportiert (Frederick und Shaw, 2007). In der Bäckerhefe S. cerevisiae findet der Transport hingegen entlang von Aktinfilamenten statt (Drubin et al., 1993; Lazzarino et al., 1994; Simon et al., 1995). Zeitweilig bestanden zwei Haupttheorien, wie der Transport der Mitochondrien erfolgt. Eine der Theorien besagt, dass die Mitochondrien mithilfe des sogenannten Arp2/3 Komplexes bewegt werden (Boldogh et al., 2001). Dieser Komplex besteht aus den beiden Aktin-verwandten Proteinen (actin-related proteins) Arp2 und Arp3 sowie fünf weiteren Proteinen. Der Arp2/3-Komplex initiiert die Entstehung von Aktin-Abzweigungen an bereits bestehenden Aktinfilamenten, wodurch sich in beweglichen Zellen an der Zellmembran Ausstülpungen (Pseudopodien) bilden, die zur Fortbewegung der Zellen führen (zusammengefasst in Pollard, 2007 sowie Pollard und Borisy, 2003). Pon und Kollegen beobachteten die Assoziation mehrerer Komponenten des Arp2/3-Komplexes mit Mitochondrien und postulierten, dass sich die Mitochondrien über Aktinpolymerisation fortbewegen. Jedoch erfolgt die Bewegung der Mitochondrien nicht frei, sondern entlang bereit bestehender Aktinfilamente (Fehrenbacher et al., 2004). Zudem ist der Transport der Mitochondrien stark eingeschränkt, wenn das Klasse V Myosin Myo2 mutiert ist (Altmann et al., 2008). Diese Beobachtungen führten zur zweiten Theorie, die mittlerweile als anerkannt

5 gilt. Diese besagt, dass Myo2 über einen bisher unbekannten Rezeptor an die Mitochondrien bindet und diese anterograd in die entstehende Tochterzelle, die sogenannte Knospe, transportiert (Altmann et al., 2008; Förtsch et al., 2011). Es findet auch ein, dem entgegengesetzter, retrograder Transport aus der Knospe in die Mutter statt. Vermutlich findet dieser Rücktransport der Mitochondrien passiv, durch den retrograden Aktinkabel-Fluss statt. Jedoch ist die Datenlage zu dieser Theorie noch nicht ausreichend. Als retrograder Aktinkabel-Fluss wird das Wachstum von Aktinkabeln von der Knospe in Richtung Mutter bezeichnet, das in Kapitel 1.5 näher erläutert wird (Higuchi et al., 2013; Yang und Pon, 2002).

Bei MYO2 handelt es sich um ein essentielles Gen. Dies ist unter anderem darauf zurückzuführen, dass das Motorprotein Myo2 auch für die korrekte Orientierung der Kernteilungsspindel mitverantwortlich ist (Hwang et al., 2003). Außerdem spielt Myo2 eine Rolle bei der Zytokinese, indem es sekretorische Vesikel an den Ort der Zellteilung transportiert (Wagner et al., 2002). Zudem werden z.B. auch Vakuolen und Peroxisomen von Myo2 transportiert (zusammengefasst in Fagarasanu et al., 2010). Neben Myo2 sind vermutlich auch Mmr1 und die kleine Rab GTPase Ypt11 am Transport der Mitochondrien beteiligt. Die Überexpression sowohl von MMR1 als auch YPT11 hat eine Akkumulation der Mitochondrien in der Knospe zur Folge (Chernyakov et al., 2013; Itoh et al., 2002, 2004).

MMR1 ist ein Faktor, der eine Rolle bei der Vererbung von Mitochondrien in die Knospe spielt.

Mmr1 liegt unter anderem in distinkten Punkten in der Knospe vor. Dort scheint Mmr1 zusammen mit dem kortikalen ER eine Rolle bei der Verankerung von Mitochondrien in der Knospe zu spielen. Ist MMR1 deletiert, so wird ein verstärkter Rücktransport der Mitochondrien von der Knospe zurück in die Mutter beobachtet (Swayne et al., 2011).

Ursprünglich wurde vermutet, es könne sich bei Mmr1 um den Myo2-Rezeptor auf den Mitochondrien handeln, daher auch die Bezeichnung Mitochondrial Myo2p Receptor-related (Itoh et al., 2004). Bei Ypt11 handelt es sich um eine Rab GTPase, die nicht nur für die Vererbung von Mitochondrien, sondern auch für die des kortikalen ERs und des späten Golgis eine Rolle spielt (Arai et al., 2008; Buvelot Frei et al., 2006; Frederick et al., 2008). Es wurde

6 unter anderem vermutet, dass Ypt11 die Vererbung des ER bedingt und Mitochondrien nur passiv mittransportiert werden. Jedoch führt eine Verankerung von Ypt11 im ER zwar zu einer Akkumulation des ER in der Knospe, die Vererbung der Mitochondrien wird dadurch aber nicht gesteigert (Lewandowska et al., 2013). Ypt11 interagiert direkt mit Myo2 und fehlt Ypt11, so ist der Eintritt der Mitochondrien in die Knospe verzögert (Itoh et al., 2002). Da jedoch die Mutation von MMR1 oder YPT11 allein den Transport von Mitochondrien lediglich verzögert und keines dieser Gene essentiell ist, ist es unwahrscheinlich, dass eines dieser Proteine der Myo2-Rezeptor der Mitochondrien ist. Sind beide Gene deletiert, so sind die Zellen nicht lebensfähig (Itoh et al., 2004). Diese Doppelmutante kann durch einen forcierten Transport der Mitochondrien gerettet werden. Dies deutet darauf hin, dass beide Gene für die Vererbung der Mitochondrien wichtig sind, jedoch in voneinander unabhängigen Reaktionswegen aktiv sind (Chernyakov et al., 2013). Ein alleiniger mitochondrialer Myo2-Rezeptor wurde demnach noch nicht identifiziert. Bereits identifizierte Myo2-Rezeptoren anderer Organellen erlauben Rückschlüsse darauf, welche Eigenschaften der mitochondriale Myo2-Rezeptor aufweisen könnte. Beispielsweise werden Vakuolen ebenfalls von Myo2 transportiert. Dabei bindet die Cargobindedomäne von Myo2 an Vac17, welches wiederum über seinen C-Terminus an das vakuoläre Membran-Protein Vac8 bindet (Ishikawa et al., 2003;

Tang et al., 2003). Nach dem Transport in die Knospe wird Vac17 abgebaut. Wird dieser Abbau verhindert, so werden Vakuolen zunächst in die Knospe transportiert, wandern daraufhin jedoch in der Knospe zurück und akkumulieren am Mutter-Knospen-Hals. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass der regulierte Abbau wichtig für die finale Lokalisierung der Vakuolen ist (Tang et al., 2003). Gleichzeitig steht so Myo2 wieder für andere Funktionen zur Verfügung. Im Falle der Peroxisomen geschieht dies über das peroxisomale Membranprotein Inp2, welches direkt mit Myo2 interagiert (Fagarasanu et al., 2006). Wird Inp2 überexprimiert, so akkumulieren Peroxisomen in der Knospe, während bei Deletion von INP2 der Transport verhindert ist. Aus diesen Erkenntnissen lässt sich ableiten, dass auch der mitochondriale Myo2-Rezeptor direkt mit Myo2 interagieren sollte. Wie im Falle des vakuolären Rezeptors ist

7 jedoch nicht auszuschließen, dass mehrere Komponenten an der Verbindung von Myo2 zu den Mitochondrien beteiligt sind. Auf jeden Fall muss der Rezeptor an den Mitochondrien lokalisiert sein. Am naheliegendsten wären dabei Proteine, die mit der mitochondrialen Außenmembran assoziiert sind. In einem ersten Ansatz hatte Johannes König bereits versucht über ein pulldown-Experiment mitochondriale Proteine zu identifizieren, die mit der Cargobindedomäne von Myo2 physikalisch interagieren. Leider war dieser Ansatz nicht erfolgreich, da dabei vor allem ATPase Untereinheiten und Proteine der Mitochondrienmatrix bestimmt wurden (König, 2012).

Um sicherzustellen, dass bei dem Transport der Mitochondrien in die Knospe genug Mitochondrien in der Mutter zurückbleiben, sind diese über Mdm36 und Num1 an der Plasmamembran verankert (Klecker et al., 2013; Lackner et al., 2013). Diese Verankerung spielt zudem eine wichtige Rolle bei der Teilung der Mitochondrien. In Δnum1 Zellen liegen die Mitochondrien als stark vernetztes Netzwerk vor, das dem von Teilungsmutanten ähnelt (Cerveny et al., 2007). Werden die Mitochondrien durch künstliche Membrananker in der Plasmamembran verankert, so kann das wildtypische Netzwerk wiederhergestellt werden (Klecker et al., 2013). Eine Übersicht der beschriebenen Komponenten der Mitochondrienvererbung ist in Abb. 1 dargestellt.

Abbildung 1: Mitochondrialer Transport in S. cerevisiae. Mitochondrien (orange) werden mithilfe von Myo2 (gelb) und Ypt11 (rot) entlang von Aktinfilamenten (lila) in die Knospe transportiert. Mmr1 (rosa) verbindet die Mitochondrien mit dem ER (grün) in der Knospe. Num1 (blau) und Mdm36 (grau) verankern die Mitochondrien in der Plasmamembran (schwarz) der Mutter.

Die Cargobindedomäne von Myo2 lässt sich in zwei Bereiche, Subdomäne I und II, einteilen (Pashkova et al., 2005). Beide Domänen sind nötig, um ein funktionelles Protein zu bilden. Sie unterscheiden sich in Struktur und Funktion. Während sich in Subdomäne I die Bindestellen für Vakuolen und Mitochondrien befinden, interagiert Subdomäne II mit sekretorischen Vesikeln und Peroxisomen (Altmann et al., 2008; Fagarasanu et al., 2006, 2010;

Hill et al., 1996; Pashkova et al., 2006; Schott et al., 1999; Tang et al., 2003). In Subdomäne I konkurrieren dabei Vakuolen und Mitochondrien teilweise um die Bindestellen (Altmann et al., 2008; Taylor Eves et al., 2012).

Austausche der Aminosäuren Leucin 1301 (L1301P) und Glutamin 1233 (Q1233R) in Subdomäne I bewirken, dass der Transport von Mitochondrien und Vakuolen in die Knospe stark beeinträchtigt ist (Altmann et al., 2008; Catlett und Weisman, 1998; Catlett et al., 2000).

Das entsprechende Allel, in dem beide Aminosäuren mutiert sind, wird als myo2(LQ)

Mitochondrien

ER Aktin

Mmr1 Num1

Mdm36

Myo2 Ypt11

9 bezeichnet (Förtsch et al., 2011). Dem entgegengesetzt resultiert die künstliche Verankerung von Myo2 in der mitochondrialen Außenmembran in verstärktem Transport in die Knospe.

Das hierfür verwendete Fusionsprotein Myo2-Fis1 besteht aus der Transmembrandomäne von Fis1, welche in der mitochondrialen Außenmembran integriert (Mozdy et al., 2000) und der Aktinbindedomäne von Myo2 (Förtsch et al., 2011; Abb. 2). Fis1 ist nicht nur an der Teilung der Mitochondrien, sondern zusätzlich auch an der Teilung von Peroxisomen beteiligt und damit auch an diesen lokalisiert (Motley et al., 2008). Die Expression von Myo2-Fis1 hat daher zusätzlich einen Effekt auf die Verteilung der Peroxisomen, welcher jedoch relativ gering ist (Förtsch et al., 2011).

Abbildung 2: Myo2-Fis1 verankert Myo2 in den Mitochondrien. Fis1*: Transmembrandomäne von Fis1; Myo2*: Motor Domäne, IQ Wiederholungen und coiled-coils von Myo2.

Mithilfe von Myo2-Fis1 kann der Mitochondrien-Vererbungsdefekt in myo2(LQ)-Mutanten aufgehoben werden (Förtsch et al., 2011). Daher sollte es möglich sein, Myo2-Fis1 für genomweite Studien einzusetzen, um nach weiteren Genen zu suchen, die am Myo2-abhängigen Transport von Mitochondrien beteiligt sind und deren Vererbungsdefekte womöglich ebenfalls durch den von Myo2-Fis1 forcierten Transport gerettet werden.

10 1.4 Alterungsprozesse in Zellen

Die Vererbung ungeschädigter Mitochondrien hat nicht nur einen Einfluss auf die Fitness der Zellen, sondern wirkt sich auch auf die Lebensspanne der Tochterzellen aus (McFaline-Figueroa et al., 2011). Schon immer beschäftigt der Mensch sich mit der Frage, warum wir altern und ob dieser Prozess zu verlangsamen oder aufzuhalten ist. Auch S. cerevisiae dient bereits seit Langem als Modellorganismus zur Untersuchung von Alterungsprozessen. Mehrere Methoden sind mittlerweile bekannt, um die Auswirkung verschiedener Mutationen auf das Altern zu untersuchen. Zu unterscheiden ist hierbei zwischen der replikativen und der chronologischen Lebensspanne der Hefen. Die replikative Lebenspanne (RLS) wird bestimmt über die Teilungen, die eine einzelne Zelle durchlaufen kann, bis sie stirbt. Da mit der Zeit Schäden in den Zellen akkumulieren, ist die Lebensspanne der Zellen nicht unendlich. Die chronologische Lebensspanne ist die Zeitspanne, die eine Hefezelle ohne Teilung überlebt. Obwohl Bakterien keine asymmetrische Teilung wie Hefen durchlaufen, konnte auch in diesen Prokaryoten replikatives Altern festgestellt werden.

Zellen, die nach der Teilung den älteren Pol eines Bakteriums enthalten, teilen sich mitunter langsamer als die Zellen, die am neu gebildeten Pol entstehen (zusammengefasst in Nyström, 2007).

Als Kontrolle für Alterungsanalysen wird mitunter die Mutante der Histon-Deacetylase SIR2 herangezogen (Landry et al., 2000). Δsir2 weist eine deutlich verkürzte RLS im Vergleich zum Wildtyp auf. Ein Grund für die verkürzte RLS sind sogenannte ERCs (extrachromosomal rDNA circles). In Δsir2 akkumulieren diese ERCs in der Mutterzelle und führen dort zu Seneszenz (Kaeberlein et al., 1999; Sinclair und Guarente, 1997). Weitere bisher beschriebene Ursachen für das Altern der Hefezellen sind unter anderem die Akkumulation von Proteinaggregaten, sowie geschädigter Mitochondrien und anderer Organellen wie dem ER (Clay et al., 2014; Fabrizio und Longo, 2003; Hill et al., 2014; McFaline-Figueroa et al., 2011).

Beschädigte Bestandteile werden mitunter durch selektive Autophagie entsorgt. Im Falle der Mitochondrien wird dieser Prozess als Mitophagie bezeichnet. Durch den Abbau von

11 Mitochondrien wird sichergestellt, dass die Menge und Qualität der Mitochondrien in der Zelle aufrechterhalten wird (Kanki et al., 2015).

Auch Proteinaggregate sind charakteristisch für die Δsir2-Mutante und für Krankheiten wie Alzheimer oder Chorea Huntington (Aguilaniu et al., 2003; Arrasate und Finkbeiner, 2012;

Erjavec et al., 2007; Gutekunst et al., 1999; Irvine et al., 2008). Während die Mutterzelle auf diese Weise mit jeder Teilung altert, werden schädliche Bestandteile nicht an die Töchter weitergegeben, sodass diese eine unverkürzte Lebensspanne aufweisen. Wie genau Proteinaggregate dabei zurückgehalten werden, ist bisher nicht eindeutig aufgeklärt. Es existieren dazu mehrere Theorien. Eine dieser Theorien besagt, dass Proteine in verschiedenen Kompartimenten in der Zelle aggregieren. Diese lokalisieren am Zellkern oder anderen Organellen, wie den Vakuolen. Diese Assoziation soll dazu beitragen, dass die Aggregate in der Mutter zurückgehalten werden. Bezeichnet wurden diese Einschlüsse als juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) oder insoluble protein deposit (IPOD) (Spokoini et al., 2012). Eine andere Theorie beschreibt, dass Aggregate vom ER auf Mitochondrien übertragen werden. Die mit diesen Aggregaten beladenen Mitochondrien wiederum werden bei der Zellteilung in der Mutter zurückgehalten. Ist die Assoziation der Aggregate mit Mitochondrien reduziert, was in der Mutante Δfis1 der Fall ist, kann eine erhöhte Vererbung der Proteinaggregate an die Knospe festgestellt werden (Zhou et al., 2014).

Nähern sich die Mutterzellen jedoch dem Ende ihrer Lebensspanne, so können nicht mehr alle geschädigten Komponenten zurückgehalten werden. Tochterzellen, die zu diesem Zeitpunkt gebildet werden, weisen eine verkürzte Lebensspanne auf (zusammengefasst in Laun et al., 2007). Unter bestimmten Bedingungen, wie z.B. vermindertem Nährstoffangebot, durchlaufen diploiden Zellen zudem Meiose, aus der vier haploide Sporen (eine Tetrade) hervorgehen. Dieser Vorgang wird als Sporulation bezeichnet (Freese et al., 1982; Herskowitz, 1988). Dabei laufen zwei meiotische Teilungen im Zytoplasma der ursprünglichen Zelle ab.

12 Dort bilden sich Plasmamembranen um die vier entstehenden haploiden Zellkerne und formen die neuen Sporen. Die ursprüngliche Zelle bildet um diese Sporen den Ascus (zusammengefasst in Neiman, 2011). Durch die Sporulation wird der Alterungsprozess rückgängig gemacht, sodass Sporen, die von gealterten Zellen stammen, eine ähnliche Lebensspanne aufweisen wie Sporen, die von jungen Zellen abstammen. Dabei wurde beobachtet, dass sowohl Proteinaggregate als auch ERCs während der Sporulation verschwinden (Unal et al., 2011).

1959 beschrieben Mortimer und Johnston, wie Hefen mit einer feinen Nadel am Mikromanipulator ausgelegt und von den entstehenden Töchtern getrennt werden können.

Nach jeder Teilung wird die Tochter von der beobachteten Zelle entfernt, bis diese schlussendlich abstirbt. Dies ermöglicht es, die RLS, d.h. die Anzahl der Teilungen bis zum Zelltod einzelner Zellen, zu bestimmen (Mortimer und Johnston, 1959). Eine weitere Methode zur Untersuchung replikativ gealterter Hefezellen ist das Mother Enrichment Program (MEP).

Dieses wurde 2009 vorgestellt (Lindstrom und Gottschling, 2009). Mutterzellen sollen angereichert werden, ohne dass deren replikative Lebensspanne beeinträchtigt wird. Dazu konstruierten die Autoren einen Hefestamm, in dem Tochterzellen bei Estradiolzugabe teilungsunfähig werden, indem über ein Cre-loxP System in den Töchtern essentielle Gene inaktiviert werden. Dies wird durch ein Fusionsprotein aus der Cre-Rekombinase des Bakteriophagen P1 und dem Östrogenrezeptor aus der Maus erreicht. Diese Rekombinase ist nur unter Zugabe von Estradiol aktiv. Zusätzlich steht das Konstrukt unter der Kontrolle eines Tochter-spezifischen Promotors und wird daher nur in den Töchtern exprimiert. Als Zielgene, die ausgeschaltet werden sollen, wurden UBC9 und CDC20 gewählt. Diese sind für das Durchlaufen der Mitose essentiell. An den Genlokus der beiden Gene wurden daher jeweils zwei loxP Rekombinationsstellen integriert, wodurch jeweils ein Exon von loxP-Stellen flankiert wurde. Bei Estradiolzugabe wird die Cre-Rekombinase in den Töchtern aktiv und wandert in den Zellkern. Dort agiert sie an den loxP-Stellen und vermittelt an diesen

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