Ein Vergleich (Abb. 33) der Aminosäuresequenz der AdoMet-Synthetase von P.
falciparum mit den Sequenzen vier anderer pro- und eukaryotischer Organismen zeigt eine hohe Identität/Homologie zwischen der P. falciparum-Sequenz und den Sequenzen der Vergleichsorganismen (E. coli 48% / 66%, H. sapiens 56% / 75%, L.
donovani 56% / 71%, T. cruzi 56% / 72%). Unter den konservierten Aminosäure-resten befinden sich auch jene, die für die Vergleichsorganismen als essentiell für die Katalyseaktivität der AdoMet-Synthetase beschrieben wurden; die mit den Resten Asp24 und Asp271 korrespondierenden Aminosäuren sind an der Bindung der Mg2+ -Ionen beteiligt, die für eine optimale Katalyseaktivität des Enzyms benötigt werden.
Jene mit Asp127 und Asp238 korrespondierenden Reste sind an der Methioninbindung und die dem Glu50 entsprechenden Reste an der Bindung des K+-Ions beteiligt
Abb 30: Inhibierung der PfAdoMet-Synthetase durch Selenomethionin. Für die Bestimmung des Ki-Werts wurden folgende Inhibitor-konzentrationen eingesetzt:
0, 50, 100, 200 µM.
Methionin (µµµµM)-1
- 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04
2 4 6 8 10 12 14 16 18
1/V (nmol min-1 mg-1 )
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(Taylor und Markham, 1999, Pérez-Pertejo, 2003). Zur Bestätigung der Hypothese, dass diese Reste auch bei dem plasmodialen Enzym essentiell für die Katalyseaktivität sind, wurden die Mutanten D24N, D127N, D238N, D271N und E50Q hergestellt, exprimiert und die Aktivität der entsprechenden Proteine ermittelt. Abb.
31 und Abb. 32 zeigen SDS-Elektrophoresegele der exprimierten Mutanten.
Abb. 31: SDS-PAGE der Mutanten D24N, D127N, D238N und D271N der PfAdoMet-Synthetase. Das rekombinante Wildtyp-Enzym diente als Kontrolle. Sowohl Induktions-, Inkubations- als auch Ni2+ -NTA-Chromatographiebedingungen der Mutanten glichen der Expression und Aufreinigung des Wildtyp-Enzyms. M: Proteinmarker, 1: rekombinante AdoMet-Synthetase, 2: Mutante D127N, 3:
Mutante D238N, 4: Mutante D24N, 5: Mutante D271N.
Abb. 32: SDS-PAGE der Mutanten E50Q und D271N der PfAdoMet-Synthetase. Das rekombinante Wildtyp-Enzym diente als Kontrolle. Sowohl Induktions-, Inkubations- als auch Ni2+ -NTA-Chromatographiebedingungen der Mutanten glichen der Expression und Aufreinigung des Wildtyp-Enzyms. M: Proteinmarker, 1: Mutante D271N, 2: Mutante E50Q, 3: Mutante E50Q, 4: rekombinante AdoMet-Synthetase.
- 85 - ERGEBNISSE
E c 1 - - --- - - -- - M AK HL F T S E SVSE G H P D K IAD Q I S D AVLDA ILE QD PK A RVAC ET Y V H s 1 M N GPV D G L C D H SL S EGV F MF T S E SVGE G H P D K ICD Q I S D AVLDA HLK QD PN AK VAC ET V C T c 1 - - --- - - -M S V RQ IL FSS EHVSE G H P D KLCD QVS D AVLDAC LA SD PLSRVAC ETCS L d 1 - - --- - - -M S V HS IL FSS EHVTE G H P D KLCD QVS D AVLDAC LA GD PFS K VAC ESC A P f 1 - - --- - - M S Q L KIK RGN FL F T S E SVNE G H P D K ICD Q I S D A I LD S C LRE D PYS K VAC EVC A
E c 4 7 KT GMV L V GG E I TTSAWVD I E E I TRNT V R EI G YVHS D MGFDA NS C A VL S AIG KQ SPD INQG H s 6 1 KT GMV L L CG E I TS MAMVDYQ RVVRDT IKHI G Y DDS AK GFDFKTC N VLVA L E QQ SPD IAQC T c 4 9 KT GMIMI F G E I TTNAVL DYQK VVRDA VKEI GFDDG EK G L D YRS C N LL I AIE HQ SPEILQS L d 4 9 KT GMV M VF G E I TTKAVL DYQKI VRNT IKDI GFDSA DK G L D YES C N VLVAIE QQ SPD ICQG P f 5 4 KK NYIFI F G E I TTKAKV N YDK VTRDVL KHI G Y DDE SK G L D Y KTA EIKV S I D E Q SPD IAQC
E c 1 0 7 VD R-A D P L E QG AG D Q GLM F G Y A TNETD V LM PA PIT YAH RLV QRQ AEV R KNGTL PWLRP DA H s 1 2 1 VH LDR N EED VG AG D Q GLM F G Y A T DET EE CM P L TII LAH KLN ARM A DLRR SGLL PWLRP DS T c 1 0 9 L G D-F D GEG LG AG D Q GMM F G Y A T DET ET FM P L TYE L S R GLA VK Y SELRR NGTL PWA RP DA L d 1 0 9 L G N-F D SED LG AG D Q GMM F G Y A T DET ET LM P L TYE LAR GLA KK Y SELRR SGSLEWA RP DA P f 1 1 4 VH ENR S PELI G AG D Q GI M F G Y A T DET EN YM P L THH YAT LL GKRLT EV R KLGIL PYLGP D G
E c 1 6 6 KSQVTF QYD D G K- - - -- - - - I V G IDAVV LSTQ HSEEID Q K SLQ E A VM EE II KP ILPA E WL H s 1 8 1 K T QVTV QYM Q D NG - - -- A V IPVRIHT I VI SVQ HNE D IT LEE MR R ALKEQV IR AVVPAKYL T c 1 6 8 K T QVTV QYE Y D SR EGRQ LLTPKR VAVV L I SAQ HDADV K NETLR KD LM EKV I KAVIPA H ML L d 1 6 8 K T QVTVE YD Y D TR EGKQ VLTPKR VAVV L I SAQ HDEH V T N D K IS VD LM EKV I KAVIPA N ML P f 1 7 4 K T QIT I E YKNK GS CGG- HLEP L R VHTV L I STQ HAE D IK YEQLKTD LM ENV I KYVIPEK L L
E c 2 1 8 T S ATK F F IN PTGRF VIG G PM GDCGLT G R K I IVDTY G GM A RH GG G A FS G K DPS K VDR S A A Y H s 2 3 7 DE DTVYHLQP S GRF VIG G PQ GD A GVT G R K I IVDTY G G W G A H GG G A FS G K DY TK VDR S A A Y T c 2 2 8 DA DTKYHL N P S GRF VIG G PH GD A GLT G R K I IVDTY G G W G A H GG G A FS G K DPS K VDR S A A Y L d 2 2 8 DAETKYWL N P S GRF VRG G PH GD A GLT G R K I IVDTY G G W G A H GG G A FS G K DPS K VDR S A A Y P f 2 3 3 DNETLY Y L N P S GK F V LG G PAA D A GLT G R K I ICDTY G G W G A H GG G A FS G K DAS K VDR S A A Y
E c 2 7 8 A ARYVA KN IV AAG L A DRC E IQVS YAI GVAEPTSIMVE T FG- -T E K VP S E QLT L LVR E FF D H s 2 9 7 A ARWVA K S L VK AG L CRRVL V QVS YAI GVAEPLSIS I F TY G- -T S Q KT E R ELL D VVH KN F D T c 2 8 8 A ARWI A K S L V AGG L ARRCL V QL AYAI GVAEPL NIH I E TY G- -T G KYDDG R I L EIVT KN FR L d 2 8 8 A ARWI A K SIV AGG L ARRCL V QL AYAI GVAEPLSMHVE TY G- -T G KYDDA KLL EIVK QN FK P f 2 9 3 Y LRFI A K S L V ANK F CRRVL V QAS YSI G I ANP I SLNVNS Y GT VST GYTDY DLEQ IILR N F D
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N-Abb. 23: Vergleich der Aminosäuresequenzen der AdoMet-Synthetasen von E. coli (Ec), H. sapiens (Hs), L. donovani (Ld) und T. cruzi (Tc) mit jener von P. falciparum (Pf). Identische Aminosäurereste sind schwarz, ähnliche grau gekennzeichnet. Die gegen Asparagin ausgetauschten Aspartatreste sowie der gegen Glutamin ausgetauschte Glutamatrest sind mit einem Pfeil gekennzeichnet.
3.8.1 Die Mutanten D127N und D238N
Die Aminosäurereste Asp127 und Asp238 wurden gegen Asparagin ausgetauscht, die jeweiligen Mutanten exprimiert und mittels des Standardaktivitätstests auf ihre Enzymaktivität untersucht. Wie aus Abb. 34 ersichtlich, zeigen beide Mutanten nur noch eine äußerst geringe Restaktivität von 1,1% (D127N) bzw. 1,4% (D238N).
- 86 - ERGEBNISSE
3.8.2 Die Mutanten D24N und D271N
Die Aminosäurereste Asp24 und Asp271 wurden ebenfalls mutiert; auch hier handelte es sich um einen Austausch des Aspartats gegen Asparagin (D24N/D271N). Wie im Falle von D127N und D238N verblieb - verglichen mit dem Wildtyp - nur eine geringe Restaktivität von 3,4% bei beiden Mutanten (Abb. 35).
3.8.3 Die Mutante E50Q
Die AdoMet-Synthetase-Aktivität ist bei allen bisher untersuchten Organismen K+ -abhängig. Der Aminosäurerest Glu50, der bei anderen AdoMet-Synthetasen für die Bindung der K+-Ionen verantwortlich ist, wurde gegen einen Glutaminrest ausgetauscht. Die PfAdoMet-Synthetase-Mutante E50Q wurde exprimiert und der
0 20 40 60 80 100
wt D127N D238N
Aktivität (%)
0 20 40 60 80 100
wt D24N D271N
Aktivität (%)
Abb. 35: Restaktivität der
PfAdoMet-Synthetase-Mutanten D24N und D271N im Vergleich zum Wildtyp.
Dargestellt sind die Mittelwerte aus 7 Versuchen
± Standardabweichung.
Abb. 34: Restaktivität der
PfAdoMet-Synthetase-Mutanten D127N und D238N im Vergleich zum Wildtyp.
Dargestellt sind die Mittelwerte aus 8 Versuchen
± Standardabweichung.
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Standardaktivitätstest mit steigenden KCl-Konzentrationen durchgeführt. Die Mutante zeigte auch bei zehnfach erhöhtem KCl-Angebot nur eine Restaktivität von 1,4%
(Abb. 36).
3.9 Effekt der PfAdoMet-Synthetase-Inhibitoren Selenomethionin und